[發明專利]利用幼嫩子房對煙草單個植株進行染色體制片的方法

在審

• 申請號: 201410557520.2
• 申請日: 2014-10-20
• 公開（公告）號: CN104297034A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 黨江波;梁國魯;向素瓊;郭啟高;汪衛星;李曉林;孫海燕
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于農業技術領域，本發明涉及一種利用幼嫩子房進行煙草染色體制片的方法，特別適用于對單個煙草植株進行染色體制片。

背景技術

植物染色體制片是進行核型分析、帶型分析和染色體原位雜交等細胞遺傳學研究的基礎，隨著近年來細胞遺傳學在植物分類學及植物育種中的應用，植物染色體制片的應用越來越廣泛。特別是在育種中，很多情況下，需對單個(株)材料進行染色體制片，且制片質量要求甚高，這在很大程度上提高了對染色體制片的要求，無疑也增加了染色體制片的難度。尤其是一些種子細小的植物材料，其制片難度更大。

目前，植物染色體制片大多采用根尖，少數采用幼嫩葉片及花器官的不同部分。煙草染色體研究中大多采用根尖進行染色體制片，但其可能需大量根尖作為處理對象，方可獲得比較優良的染色體標本。但是煙草育種過程中，往往會獲得的部分具有染色體結構和數目發生變異的特殊材料。在研究過程中，要求對這部分材料的每個單株進行染色體制片。由于煙草種子細微，萌發后的根也較小，這給對單個植株進行染色體制片造成極大的難度，且根尖的切取往往對植株造成不利的影響，如影響生長勢、感染病菌等。

因此，開發一種取材方便，可獲得較多分裂相的制片方法對在煙草育種中篩選染色體變異株系并對其進行細胞遺傳學研究有著非常廣闊的應用前景。有學者報道采用葉片、組織培養材料進行煙草染色體制片的方法。但是由于葉片多居間分生組織，無法獲得大量分裂相，不能滿足后續分析需要；而組織培養的材料含水量較高，且老化組織和幼嫩組織混合，也難以獲得良好的染色體制片。由于煙草花序發育較快，在單核小孢子期前子房生長迅速。因此，選用這一時期的子房作為材料進行染色體制片時合適的。且煙草花期較長，有大量材料可供選擇進行染色體制片。目前，還未見有關利用煙草幼嫩子房進行染色體制片的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種取材方便，可獲得較多分裂相、分裂相染色體較為舒展的制片方法。為實現上述發明目的，本發明擬采用如下技術方案：

本發明涉及一種利用幼嫩子房進行煙草染色體制片的方法，其特征包括如下步驟：

(1)取材：于花期對單個煙草植株進行取材，取材時間為晴朗早上8:00-9:00之間，取材對象為幼小花蕾，以小孢子母細胞減數分裂期花蕾為佳，因不同材料花蕾大小存在差異；

(2)預處理及固定：用眼科鑷將花蕾取下，去掉花柄后放入裝有蒸餾水的小玻璃管中，輕輕振蕩使花蕾浸入溶液中。后置于4℃冰箱放置18-24h(溫度及時間可根據染色體形態自行調整)，吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定過夜；

(3)后續采用直接涂片、酶解后壓片或涂片方法得煙草染色體制片。

任選地，壓片后直接觀察，獲得良好中期分裂相，如需后續試驗和長期保存，可采用常規方法揭片；直接涂片和酶解后涂片還包括染色步驟:用5％吉姆薩溶液進行染色,染色體時間控制在30秒至1分鐘之間。

在本發明的一個優選實施方式中，所述的直接涂片包括如下步驟：從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝去花萼、花冠、雄蕊和柱頭；用鑷子夾取子房使其碎裂為小塊，用鑷尖夾取小塊組織并滴加少量卡洛氏固定液于鑷尖，直接在清潔、干燥的載玻片上涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于涂布好材料的載玻片上，將固定液沿載玻片一端輕輕吹散開；于酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。

在本發明的一個優選實施方式中，所述的酶解壓片、涂片包括如下步驟：

(4)酶解：從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝去花萼、花冠、雄蕊和柱頭，切除花托，并將子房分解為合適大小(邊長約1-1.5毫米的方形塊)后置于離心管中，加入蒸餾水清洗2次，后加入蒸餾水浸泡約20分鐘，吸出蒸餾水，加入混合酶液(3％纖維素酶+0.03％果膠酶，不同廠家、批次的酶液可適當調節濃度)，酶和子房體積比為8-12:1，浸沒材料，震蕩使組織塊在酶液中懸浮，于35℃恒溫箱中放置,1.0-1.5小時(可根據材料調整)后取出；

(5)低滲處理：酶解后的材料從恒溫箱中取出后，尖嘴吸管吸出酶液，加入蒸餾水，放置10-15分鐘后吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液；

(6)壓片：用鑷子小心夾取材料，至于清潔干燥的載玻片中央，滴加一滴卡包品紅染色液，用鑷子反復夾取材料使其分散于染液中，染色約1分鐘后，夾取清潔蓋玻片常規方法壓片即可。

可選擇地：