[發(fā)明專利]利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410557520.2
• 申請(qǐng)日: 2014-10-20
• 公開（公告）號(hào): CN104297034A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黨江波;梁國(guó)魯;向素瓊;郭啟高;汪衛(wèi)星;李曉林;孫海燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/28
• 分類號(hào): G01N1/28;G01N1/30
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)取材：于花期內(nèi)進(jìn)行取材，取材時(shí)間為晴朗早上8:00-9:00之間，取材對(duì)象為幼小花蕾，以小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期花蕾為佳，因不同材料花蕾大小存在差異；

(2)預(yù)處理及固定：用鑷子將花蕾取下，去掉花柄后放入裝有蒸餾水的小玻璃管中，輕輕振蕩使花蕾浸入溶液中，快速置于4℃冰箱中放置18-24h(溫度及時(shí)間可根據(jù)染色體形態(tài)自行調(diào)節(jié))，吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定過夜；

(3)后續(xù)采用直接涂片、酶解后壓片或涂片方法得煙草染色體制片；

任選地，壓片后直接觀察，獲得良好中期分裂相，如需后續(xù)試驗(yàn)和長(zhǎng)期保存，可采用常規(guī)方法揭片；直接涂片和酶解后涂片還包括染色步驟:用5％吉姆薩溶液進(jìn)行染色,染色體時(shí)間控制在30秒至1分鐘之間。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法，所述的直接涂片包括如下步驟：從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝?nèi)セㄝ唷⒒ü凇⑿廴锖椭^；用鑷子夾取子房使其碎裂為小塊，用鑷尖夾取小塊組織并滴加少量卡洛氏固定液于鑷尖，直接在清潔、干燥的載玻片上涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于涂布好材料的載玻片上，將固定液沿載玻片一端輕輕吹散開；于酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幼嫩子房對(duì)煙草單個(gè)植株進(jìn)行染色體制片的方法，所述的酶解壓片和涂片包括步驟(4)－(6)：

(4)酶解：從玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科鑷剝?nèi)セㄝ唷⒒ü凇⑿廴锖椭^，切除花托，并將子房分解為合適大小(邊長(zhǎng)約1-1.5毫米的方形塊)后置于離心管中，加入蒸餾水清洗2次，后加入蒸餾水浸泡約20分鐘，吸出蒸餾水，加入混合酶液(3％纖維素酶+0.03％果膠酶，不同廠家、批次的酶液可適當(dāng)調(diào)節(jié)濃度)，酶和子房體積比為8-12:1，浸沒材料，震蕩使組織塊在酶液中懸浮，于35℃恒溫箱中放置,1.0-1.5小時(shí)(可根據(jù)材料調(diào)整)后取出；

(5)低滲處理：酶解后的材料從恒溫箱中取出后，尖嘴吸管吸出酶液，加入蒸餾水，放置10-15分鐘后吸出蒸餾水，加入卡洛氏固定液；

(6)壓片：用鑷子小心夾取材料，置于清潔干燥的載玻片中央，滴加一滴卡寶品紅染色液，用鑷子反復(fù)夾取材料使其分散于染液中，染色約1分鐘后，夾取清潔、干燥蓋玻片常規(guī)方法壓片即可；

可選擇地：

涂片：用鑷子夾取材料，并于鑷尖滴加卡洛氏固定液，在清潔的載玻片上快速涂抹，待材料涂布均勻后，滴加一滴固定液于載玻片上涂布好材料范圍的中央，將固定液沿四周輕輕吹散開，酒精燈火焰上微烤至固定液呈液滴狀即可。