[發明專利]NDM?1 鎖核酸探針修飾電極及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410557136.2
• 申請日: 2014-10-20
• 公開（公告）號: CN104237353B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 張立群;王云霞;府偉靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/327
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于電化學檢測領域，具體涉及NDM-1鎖核酸(Locked?nucleic?acid，LNA)探針修飾電極，還涉及該電極的制備方法和應用。

背景技術

目前研究報道的傳感器表面固定的大多是DNA探針，存在諸多缺點。探針長度一般為20個堿基左右，DNA探針與較長的靶序列雜交時，結合力不高，堿基錯配識別能力低。另外，由于單鏈DNA無法與未解旋的雙鏈靶序列直接結合，所以待檢測的標本需經PCR擴增后才能與之反應。同時，NDM-1探針的反應受離子強度的影響，酸性或堿性環境中DNA固定數量最多，而中性條件下雜交效果最好，固定雙鏈探針比固定單鏈探針時雜交效果好，分析原因可能是單鏈固定時會對雜交產生更大的空間障礙。眾多的研究者均未能很好地解決上述問題，從而無法提高DNA探針的特異性。而LNA的出現是解決以上問題的理想途徑。

鎖核酸是一種新型、特殊的雙環狀寡核苷酸衍生物，含有一個或多個2'-0,4'-C-亞甲基-B-D-呋喃核糖核酸單體，結構中核糖的2'-0,4'-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，連接成環形，呋喃糖的結構鎖定在C3內型的N構型，形成了剛性的縮合結構，降低了核糖體構象的可塑性，增強了磷酸鹽骨架局部結構的穩定性，從而形成剛性縮合結構。相比其他寡核苷酸，LNA具有諸多優勢：(1)和DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩定性；(2)抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩定性；(3)LNA-DNA雜交物能激活RNaseH；(4)與RNA/DNA雜交時，具有較強的堿基錯配識別力；(6)水溶性好；(7)高效的自動寡聚化作用，合成方法簡單。

NDM-1多重耐藥菌是指攜帶NDM-1耐藥基因的細菌。NDM-1耐藥酶其全稱是“新德里金屬-β-內酰胺酶”，是一種高效耐藥酶。研究顯示，抗生素濫用是NDM-1出現的首要原因，目前DM-1多重耐藥菌正在全球快速傳播，其感染病例在全球均有分布，死亡率高。多重耐藥菌所帶來的風險越來越大，防控形勢極為嚴峻，該類細菌對幾乎所有抗生素都具有抗藥性。NDM-1耐藥基因可以在細菌之間傳播，從而使對抗生素敏感的細菌獲得耐藥性。因此，研發NDM-1直接快速特異的檢測方法，具有重要意義。

目前，NDM-1多重耐藥菌的診斷主要包括篩查、表型確認和基因確證等3個步驟。表型篩查是在細菌藥物敏感性測定中，以美洛培南或亞胺培南紙片法(K-B法)或最低抑菌濃度(MIC)測定法對腸桿菌科細菌產酶情況進行初步篩查；表型確認是采用雙紙片協同實驗或亞胺培南(美洛培南)/EDTA復合紙片，進行K-B法藥敏試驗來判定產金屬酶；基因確證是采用NDM-1的基因特異引物進行PCR擴增及產物測序，確定菌株是否攜帶NDM-1基因。但這些診斷方法存在著費時煩瑣、敏感性和特異性較低及檢測成本高等缺陷。

電化學DNA生物傳感器具有分析時間短、設備微型化、特異性強、靈敏度高、檢測限低、使用簡單以及成本低廉等顯著優點。目前電化學生物傳感器的研究主要是致力于提高傳感器的特異性和靈敏度，而特異性和靈敏度在很大程度上受探針與互補鏈間的相互作用影響，因此，利用LNA探針提高電化學生物傳感器的特異性是檢測NDM-1的基因的關鍵。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供NDM-1鎖核酸探針修飾電極；本發明的目的之二在于提供所述NDM-1鎖核酸探針修飾電極的制備方法；本發明的目的之三在于提供含有檢測NDM-1的電化學生物傳感器；本發明的目的之四在于提供所述NDM-1鎖核酸探針修飾電極或所述電化學傳感器的應用；本發明的目的之五在于提供利用所述檢測NDM-1的電化學生物傳感器檢測NDM-1基因的方法。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

1、NDM-1鎖核酸探針修飾電極，所述電極是在金電極表面固定5’端修飾巰基的NDM-1LNA探針，最后封閉非特異性吸附位點而得。

優選的，所述5’端修飾巰基的NDM-1鎖核酸探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2、所述NDM-1鎖核酸探針修飾電極的制備方法，包括如下步驟：

a.將金電極打磨，拋光，清潔，干燥，得清潔的金電極，備用；

b.向步驟a所得清潔的金電極表面滴加含5’端修飾巰基的NDM-1?LNA探針的溶液，修飾后用巰基己醇溶液封閉，超純水清洗得NDM-1鎖核酸探針修飾電極。