[發明專利]一種優化信號肽提高胰蛋白酶胞外分泌表達的方法

有效

• 申請號: 201410555749.2
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104312933A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;張云豐;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/76;C12R1/84
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

1.一種產胰蛋白酶的重組酵母菌，其特征在于，是在核苷酸序列是SEQ?ID?NO.9所示序列的胰蛋白酶基因前融合核苷酸序列是SEQ?ID?NO.7所示序列的信號肽形成重組基因，將重組基因在宿主菌中進行表達得到的重組酵母菌。

2.根據權利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述重組酵母菌的出發宿主菌是以下任意一種：pichia?pastoris?GS115、pichia?pastoris?KM71、pichia?pastoris?X-33、pichia?pastoris?SMD1168。

3.根據權利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述重組酵母菌的出發宿主菌是pichia?pastoris?GS115。

4.根據權利要求1所述的重組酵母菌，其特征在于，所述信號肽被核苷酸序列為以下任意一種的信號肽所替代：SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6或者SEQ?ID?NO.8。

5.一種權利要求1所述重組酵母菌的構建方法，是在核苷酸序列是SEQ?ID?NO.9所示的序列的胰蛋白酶基因之前添加核苷酸序列是SEQ?ID?NO.7所示序列的信號肽形成重組基因，將該重組基因連接到表達質粒中形成重組質粒，再轉化到宿主酵母菌中得到重組菌。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述表達質粒是以下任意一種：pGAP?ZA、pAO815、pGAPαA、pPIC9K、pPIC?ZB。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述表達質粒pPIC9K。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述構建方法為：(1)合成序列是SEQ?ID?NO.9所示序列的基因片段；(2)以步驟1的基因片段為模板，使用序列是SEQ?ID?NO.11、SEQ?ID?NO.12所示的引物進行PCR，PCR產物回收后作為模板，用序列是SEQ?ID?NO.10、SEQ?ID?NO.12所示的引物進行PCR獲得重組基因；(3)用NotI、BamHI雙酶切步驟2得到的重組基因和pPIC9K質粒，用連接酶連接得到重組質粒；(4)將步驟3得到的重組質粒轉化到pichia?pastoris?GS115中，即得到重組畢赤酵母菌。

9.權利要求1所述重組酵母菌在胰蛋白酶生產方面的應用。