[發(fā)明專利]一種優(yōu)化信號(hào)肽提高胰蛋白酶胞外分泌表達(dá)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410555749.2
• 申請(qǐng)日: 2014-10-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104312933A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康振;陳堅(jiān);張?jiān)曝S;堵國(guó)成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12N9/76;C12R1/84
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種優(yōu)化信號(hào)肽提高胰蛋白酶胞外分泌表達(dá)的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

胰蛋白酶作為絲氨酸蛋白酶中的較早被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用的一種重要類型，最早被發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物的腸道消化液中。商品化的胰蛋白酶多從哺乳動(dòng)物胰臟提取，由于胰臟中含豐富的蛋白酶，對(duì)胰蛋白酶分離提純帶來(lái)困難。另外，哺乳動(dòng)物來(lái)源的胰蛋白酶多為胰酶混合物，在醫(yī)藥應(yīng)用上存在對(duì)人體的免疫原性危害。

近年，動(dòng)物來(lái)源的胰蛋白酶通過(guò)基因工程手段在大腸桿菌、畢赤酵母中得到表達(dá)，但是，大腸桿菌表達(dá)常出現(xiàn)包涵體，畢赤酵母酶原表達(dá)豬、牛胰蛋白酶需要外源的腸激酶、胰蛋白酶體外激活。灰色鏈霉菌胰蛋白酶研究，Koo-Bon-Joon等利用鏈霉菌常用宿主Streptomyces?lividans1326及鏈霉菌常用的pWHM3質(zhì)粒(Ermp，紅霉素啟動(dòng)子)獲得在同屬菌中分泌表達(dá)的重組胰蛋白酶，Chi-Won-Jae等將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到能夠產(chǎn)胰蛋白酶的灰色鏈霉菌Streptomyces?griseus?IFO13350中表達(dá)，Daisuke?Nohara等人(1998)將鏈霉菌胰蛋白酶以包涵體形式在E.coli系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。已有研究在畢赤酵母中以胰蛋白酶形式表達(dá)了灰色鏈霉菌來(lái)源的胰蛋白酶。

異源表達(dá)胰蛋白酶突出的問(wèn)題是，蛋白表達(dá)量低、胰蛋白酶酶活低。因此，構(gòu)建用于畢赤酵母胞外分泌信號(hào)肽，提高胰蛋白酶胞外酶活，對(duì)于滿足胰蛋白酶工業(yè)化成產(chǎn)需求和降低生產(chǎn)成本有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種產(chǎn)胰蛋白酶的重組酵母菌，是在核苷酸序列是SEQ?ID?NO.9所示序列的胰蛋白酶基因前融合核苷酸序列是SEQ?ID?NO.7所示序列的信號(hào)肽形成重組基因，將重組基因在宿主菌中進(jìn)行表達(dá)得到的重組酵母菌。

所述信號(hào)肽，其核苷酸序列為以下所示序列的任意一種：SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7或者SEQ?ID?NO.8。

所述信號(hào)肽，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其核苷酸序列是SEQIDNO.7所示的序列。

所述重組酵母菌的出發(fā)宿主菌是以下任意一種：pichia?pastoris?GS115、pichia?pastoris?KM71、pichia?pastorisX-33、pichia?pastoris?SMD1168。

所述重組酵母菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其出發(fā)宿主菌是pichia?pastoris?GS115。

本發(fā)明還提供一種所述重組酵母菌的構(gòu)建方法，是在核苷酸序列是SEQ?ID?NO.9所示的序列的胰蛋白酶基因之前添加核苷酸序列是SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7或者SEQ?ID?NO.8任一所示序列的信號(hào)肽形成重組基因，將該重組基因連接到表達(dá)質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到酵母菌中得到重組菌。

所述重組菌的構(gòu)建方法具體如下：依據(jù)合成的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示的來(lái)源于灰色鏈霉菌(Streptomyces?griseus)的胰蛋白酶基因(mt)、核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1至SEQ?ID?NO.8所示的8種信號(hào)肽(分別命名為αas,Sas,Ipr,Iss,Lss,nsB,αmf,Kps)設(shè)計(jì)引物，采用兩步PCR方法分別將信號(hào)肽添加到胰蛋白酶基因前獲得重組基因(αas-mt,Sas-mt,Ipr-mt,Iss-mt,Lss-mt,nsB-mt,αmf-mt,Kps-mt)；將所述的重組基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒；將所述的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母Pichia?pastoris?GS115，獲得重組酵母工程菌株。

所述重組基因是采用兩步PCR方法獲得的含有信號(hào)肽序列和胰蛋白酶基因序列的的重組基因。

所述表達(dá)質(zhì)粒是以下任意一種：pGAPZA、pAO815、pGAPαA、pPIC9K、pPICZB。

所述表達(dá)載體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是pPIC9K質(zhì)粒。

所述表達(dá)載體和宿主菌購(gòu)自Invitrogen公司。

本發(fā)明還提供一種提高胰蛋白酶胞外分泌表達(dá)的方法，是使用上述構(gòu)建的重組酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，表達(dá)胰蛋白酶。