[發明專利]一種植物乳桿菌代謝產物抑制性的分析方法及應用

在審

• 申請號: 201410555716.8
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104561227A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 陳衛;張秋香;姚沛琳;王剛;田豐偉;劉小鳴;趙國忠;趙建新;張白曦;張灝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;A61K35/747;A61P1/02;C12R1/25;C12R1/46
• 代理公司: 無錫互維知識產權代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛偉

1.一種植物乳桿菌代謝產物抑制性的分析方法，其特征在于：包括，

植物乳桿菌FB-T9代謝產物對變異鏈球菌生物膜形成的影響分析，其包括：

(a)對變異鏈球菌生物膜形成量的影響：

制備變異鏈球菌菌懸液；

在0h時，在培養介質中加入變異鏈球菌菌懸液，在培養中的第0h，第6h，第12h這三個時間點，分別加入植物乳桿菌FB-T9發酵上清液，一起培養到24h；或者把變異鏈球菌單獨培養24h或48h，去除培養基及浮游的細菌，再加入植物乳桿菌FB-T9發酵上清液；

陰性對照組和陽性對照組分別加入等量的生理鹽水和醋酸氯己定溶液；

培養結束后，棄游離細菌，去離子水洗滌，自然干燥；

加入結晶紫溶液，室溫下染色，使結合的細菌著色；

傾去染色液后，去離子水洗滌，干燥后加入混合的乙醇/丙酮混合液顯色，酶標儀600nm測定吸光度；

(b)對變異鏈球菌生物膜結構和活性的影響：

生物膜標本制備：在培養皿中加入變異鏈球菌菌懸液和含有0.25％蔗糖的TSB培養基，在培養時間為第0h、6h、12h時分別加入植物乳桿菌FB-T9發酵上清液，每個時間點培養3個樣品，厭氧培養24h，PBS沖洗，去除表面浮游細菌，立即于室溫下暗箱中染色；或者先培養變異鏈球菌，形成24h或48h生物膜后，去除培養基，PBS洗滌，去除表面浮游細菌，加入植物乳桿菌FB-T9發酵上清液，厭氧培養24h，去除浮游菌，熒光染色；

熒光染料的配制及染色：用熒光染料CFSE、PI分別對活菌、死菌進行染色，使得活細菌、死細菌分別發出綠色熒光，紅色熒光，從而可以觀察到生物膜結構，染色結束后用PBS洗滌，除去殘留染料；

激光共聚焦顯微鏡觀察：將上述已完成熒光染色的生物膜標本放置在CLSM下觀察，物鏡×20，目鏡×10，觀察生物膜結構的激發光為510/480。以樣本最強信號點為焦平面，以該平面為參照點，沿Z軸進行2um為步距進行斷層掃描，最后進行三維重建，得到生物膜立體結構，處理記錄生物膜厚度、細菌總面積、活菌面積、死菌面積及計算活菌百分比；

植物乳桿菌FB-T9代謝產物對變異鏈球菌生物膜中胞外多糖的影響分析：采用如步驟(b)中的方法制備生物膜標本，用熒光染料使胞外多糖發出藍色熒光，用CLSM觀測時使用的激發光為400～490nm；

對生物膜狀態下變異鏈球菌合成不溶性胞外多糖的影響分析，其包括：

在聚苯乙烯細胞培養皿中，加入變異鏈球菌菌懸液和含有0.25％蔗糖的TSB培養基，厭氧培養；

在變異鏈球菌24h生物膜形成中的第0h、6h、12h時加入植物乳桿菌FB-T9發酵上清液，24h后去除培養基，PBS洗滌，去除表面浮游的細菌；或者加入變異鏈球菌菌懸液和含有0.25％蔗糖的TSB培養基，厭氧培養，形成24h或者48h生物膜，去除培養基，PBS洗滌，去除表面浮游的細菌，加入植物乳桿菌FB-T9發酵上清液，厭氧培養24h，去除孔內的液體，PBS洗滌，去除表面浮游的細菌；

加入NaOH，收集菌體，收集上清液，沉淀再用NaOH洗滌，合并上清液，作為水不溶性胞外多糖的樣品；

用蒽酮-硫酸法測胞外多糖的含量。

2.如權利要求1所述的植物乳桿菌代謝產物抑制性的分析方法，其特征在于：在對所述植物乳桿菌FB-T9代謝產物對變異鏈球菌生物膜形成的影響分析之前，還包括：

用不同溫度處理植物乳桿菌FB-T9的發酵上清液，再通過抑菌實驗觀察其抑菌性的變化情況，得到有效抑菌物質具有熱穩定性，排除大分子蛋白質作為抑菌物質的可能；

把植物乳桿菌FB-T9的發酵上清液的pH調到不同的值，再通過抑菌實驗觀察其抑菌性的變化情況，得到有效抑菌物質具有pH依賴性，即pH越低，抑菌效果越好；

用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理植物乳桿菌FB-T9的發酵上清液，再通過抑菌實驗觀察其抑菌性的變化情況，得到抑菌效果顯著下降，證明其有效抑菌物質中主要含有小分子多肽類細菌素；

用過氧化氫酶處理植物乳桿菌FB-T9的發酵上清液，再通過抑菌實驗觀察其抑菌性的變化情況，得到抑菌效果下降，說明其有效抑菌物質中含有過氧化氫。

3.一種植物乳桿菌FB-T9的代謝產物在治療和預防齲齒方面的應用。