[發明專利]非洲豬瘟病毒VP73蛋白特異性多克隆抗體的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201410554643.0
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104311660A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 陶虹;花群義;呂建強;曹琛福;劉建利;靳雯雯;楊俊興;張彩虹;孫潔;唐金明;廖立珊
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;G01N33/569
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 劉杉

技術領域

本發明涉及基因工程技術和免疫學技術領域，具體涉及抗非洲豬瘟病毒抗原性結構蛋白VP73蛋白特異性腹水多克隆抗體，以及制備方法和用途。

非洲豬瘟(African?swine?fever，ASF)主要是由非洲豬瘟病毒(African?swine?fever?virus，ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,是世界動物衛生組織(OIE)規定的法定報告動物疫病。臨床上以高熱、皮膚充血、內臟器官出血、高死亡率為特征。非洲豬瘟自1921由肯尼亞首次報道以來，已蔓延至非洲、歐洲、美洲加勒比海地區和歐亞接壤地區的49個國家。無論在非洲豬瘟新發地區還是流行地區，疫情的爆發和流行都會對發病國家產生嚴重的社會經濟影響。非洲豬瘟雖然不感染人，但對于那些把豬肉及其相關豬制品作為主要動物蛋白來源的國家，非洲豬瘟的流行大大降低了豬產品的供應能力，改變當地居民的飲食結構，間接對人體健康造成危害。

ASFV屬于雙鏈DNA病毒目(dsDNA)、非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)，而且是其唯一已知的代表物種。ASFV有囊膜呈二十面體對稱，平均直徑200nm，結構復雜。基因組約為170-192kb，與痘病毒相似，具有發夾結構、末端反向重復序列以及早期RNA合成所必需的酶。整個基因組有151個ORF，其編碼的蛋白中有131種病毒蛋白的結構和功能已有報道。

ASFV可以編碼34種以上的結構蛋白，VP73蛋白作為ASFV主要的抗原性結構蛋白，包含396個氨基酸，分子量約為44.8KDa，抗原性穩定，能夠誘導機體產生中和抗體，選擇ASFV?VP73蛋白作為免疫原制備特異性的單克隆抗體、多克隆抗體，從而建立ELISA、免疫印跡技術、間接免疫熒光等方法來檢測ASF具有明顯的優勢性。

2007年至2014年7月，越來越多的國家遭受到非洲豬瘟的侵襲，先后在格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯、烏克蘭、白俄羅斯等國暴發，造成巨大的經濟損失，也嚴重威脅我國的養豬業。俄羅斯：6月20日-7月8日在卡盧加州、斯摩棱斯克州、普斯科夫州、諾夫哥羅德州發生12起非洲豬瘟疫情，發病野豬5頭，病死野豬4頭，野豬病死率80％，撲殺野豬1頭；發病豬34頭，病死豬23頭，病死率67.65％。拉托維亞：7月2日-13日發生11起非洲豬瘟疫情，發病野豬10頭，病死野豬9頭，銷毀野豬1頭；發病豬4頭，撲殺豬47頭。波蘭：6月-7月在波德拉謝省發生4非洲起豬瘟疫情，發病野豬12頭，病死野豬12頭。立陶宛：2014年7月底，在立陶宛伊格納利納區一家大型農場發現大規模非洲豬瘟疫情，該農場約2萬頭豬都被宰殺，以防止疫情擴散。8月，立陶宛又在烏泰納區一家私人農場發現非洲豬瘟疫情。

隨著非洲豬瘟流行的區域在逐漸擴大并有蔓延至我國的風險，已經引起我國的獸醫工作者們的高度重視并開展相關儲備性研究，針對ASFV相關基因的多克隆抗體的制備已有相關報道，多是采用將抗原免疫兔或大鼠收獲抗血清，如李洪利等(2012)利用原核表達的VP73蛋白免疫新西蘭大白兔獲得抗VP73蛋白多克隆抗體的高免血清；如何提供一種快速、經濟、特異性良好的多克隆抗體制備方法無疑會加速我國對非洲豬瘟免疫學研究以及及早的建立非洲豬瘟血清學檢測方法奠定基礎。

目前，實驗室制備多克隆抗體一般采用將提純的病毒核芯顆?；虮磉_抗原免疫大白兔或大鼠后獲得相應的兔源、鼠源的抗血清多克隆抗體，但未見利用腹水制備多克隆抗體的制備方法。本發明首次提出了抗ASFV?VP73蛋白腹水多克隆抗體的制備，制備的腹水多克隆抗體特異性效果等同于常規抗血清制備方法獲得的多克隆抗體，但與常規方法相比，腹水多克隆抗體的制備有著抗原用量少、經濟、易操作、腹水可反復抽取等優點，制備的腹水多克隆抗體已通過本實驗在Western?blot、ELISA等檢測技術上成功應用。制備的ASFV?VP73蛋白腹水多抗能與VP73原核表達蛋白發生特異性結合，而對照無蛋白帶出現，說明所獲得的多抗對VP73原核表達蛋白具有良好的特異性。因此，腹水多克隆抗體的制備方法可以代替常規抗血清制備多克隆抗體方法，不僅對研究ASFV?VP73蛋白的功能有重大意義，而且對建立特異、敏感、快速的ASFV免疫學檢測方法(如ELISA)也有重要的意義。

【發明內容】

本發明的目的在于，提供一種經濟、易操作、抗體特性好的抗ASFV?VP73蛋白腹水多克隆抗體的制備方法。腹水多克隆抗體的制備方法可以代替常規抗血清制備多克隆抗體方法。

本發明的內容涉及一種非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：