[發明專利]一種過敏原陽性血清的純化制備方法

在審

• 申請號: 201410553626.5
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN104977401A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 王洪;李慶春;孫嬋;夏波;秦楓;錢林;王秀偉
• 申請（專利權）人: 蘇州浩歐博生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛;汪青

技術領域

本發明屬于體外診斷技術領域，具體涉及一種過敏原陽性血清的純化制備方法。

背景技術

過敏是一種機體的變態反應，是人對正常物質(過敏原)的一種不正常的反應，當過敏原接觸到過敏體質的人群才會發生過敏，過敏原有花粉、粉塵、異體蛋白、化學物質、紫外線等幾百種。在過敏反應的發生過程中，過敏介質起著直接的作用，過敏原是過敏病癥發生的外因，而機體免疫能力低下，大量自由基對肥大細胞和嗜堿粒細胞的氧化破壞是過敏發生的內因。一般來講，當過敏原第一次進入機體時，與肥大細胞或者是嗜堿性粒細胞結合，產生白三烯，前列腺素等等的過敏因子，但并不會立即產生過敏，此特性有些將維持2～3天，有的數月。當機體第二次接受這種過敏原時，肥大細胞才會變形，產生過敏因子，也就產生了一系列的過敏現象。

過敏可以是體液(抗體)或者是細胞免疫機制介導的。在大多數情況下，可產生過敏反應的抗體屬于IgE類，這些個體可以歸類于患有IgE介導的過敏反應。然而，并非所有的特異反應性個體都會發生與IgE相關的過敏反應；在非IgE介導的過敏反應中，抗體也可以屬于IgG類，例如：包含右旋糖苷的免疫復合物導致的過敏性休克和和現在罕見的血清病，它們以前被歸于III型過敏反應。在患有過敏性支氣管肺曲霉菌病(ABPA)病人中，IgE和IgG抗體都可以被檢出。接觸性過敏性皮炎是以淋巴細胞為介導的過敏性疾病的代表。IgE檢測仍是公認的過敏檢測的主流產品，由于點刺注冊問題和體外檢測技術的提高，體外檢測今后將是過敏檢測主流趨勢；但是目前IgE檢測學術進展遲緩，基本沒有新的發展，因此提高檢測質量和降低檢測成本是主要開發方向。

但是，由于過敏診斷試劑的發展緩慢以及前期人們的重視度有限，除了部分過敏原可以購買到商業血清，大部分過敏原的陽性血清還是很難查詢到的，臨床收集少量可行，大量或者高濃度的血清基本不能收集到，甚至于很多項目很少有合適的陽性血清(如：牛肉、羊肉)。

如公布號為CN103018436A，公布日為2013-4-3的一種用家兔制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，其在經過免疫取血后，僅將血液分離出血清，對血清進行離心過濾就得到陽性血清。但是，該陽性血清存在使用效果不好的問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種使用效果優良的過敏原陽性血清的純化制備方法。

為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案：

一種過敏原陽性血清的純化制備方法，包括用過敏原對健康動物進行免疫、采血后獲得抗血清的步驟和對所述的抗血清進行純化獲得陽性血清的步驟，所述的純化的具體方法為：

對所述的抗血清進行親和純化得到IgG抗體；將所述的IgG抗體和人IgE?Fc按質量比為1:1～2偶聯后，經分離純化獲得IgG-IgE?Fc連接物濃溶液，將所述的IgG-IgE?Fc連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5～1μg/ml，即得所述的陽性血清。

優選地，采用瓊脂糖親和介質或者采用免疫親和層析柱進行所述的親和純化。

進一步優選地，所述的瓊脂糖親和介質為Protein-A?sepharose?CL-4B。

進一步優選地，所述的免疫親和層析柱為所述的過敏原與瓊脂糖凝膠連接成的親和層析柱。

進一步優選地，所述的抗血清先經過硫酸銨處理后，再采用所述的免疫親和層析柱進行所述的親和純化。

優選地，所述的人IgE?Fc是將人源IgE溶解木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白酶消化，再用碘乙酰胺終止消化反應后，用瓊脂糖親和介質提取獲得的。

優選地，所述的IgG抗體和所述的人IgE?Fc通過2-亞胺四氫噻吩偶聯劑或4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯劑活化后，在pH?7.2～7.4的條件下進行所述的偶聯。

進一步優選地，所述的2-亞胺四氫噻吩偶聯劑的濃度為9～11mg/ml，所述的4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯劑的濃度為4～6mg/ml。

優選地，采用Sephadex?200凝膠純化柱進行所述的分離純化。

優選地，采用含質量比為0.4～0.6％的牛血清白蛋白、pH?7.5～8.5、0.09～0.11mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將所述的IgG-IgE?Fc連接物濃溶液進行所述的稀釋。

由于以上技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點：