[發(fā)明專利]有氧下可提升重組蛋白質(zhì)表現(xiàn)的菌株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410553469.8
• 申請(qǐng)日: 2014-10-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104371964B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙云鵬;姜中人;何宜靜;王祉雯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 逢甲大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/09;C12R1/19
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所31272
• 代理人: 吳俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明關(guān)于一種利用基因工程技術(shù)建構(gòu)的菌株，且特別關(guān)于一種有氧下可提升重組蛋白質(zhì)表現(xiàn)的大腸桿菌菌株。

背景技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)為一耗能的生理現(xiàn)象，而消耗的能量大多由細(xì)胞攝取、代謝的碳源所供應(yīng)。因此，若欲提升細(xì)胞內(nèi)重組蛋白質(zhì)的表現(xiàn)量，細(xì)胞須大量攝取并代謝碳源。葡萄糖因容易攝取、代謝，故為這些碳源中最為常見(jiàn)者。

大腸桿菌代謝葡萄糖時(shí)，葡萄糖會(huì)抑制乳糖、蜜二糖、麥芽糖、與甘油等碳源的穿透酶活性，使菌體無(wú)法代謝這類碳源。這過(guò)程稱為「誘導(dǎo)物排除(inducer exclusion)」。同時(shí)，葡萄糖亦會(huì)抑制環(huán)化酶(adenylyl cyclase)活性，使環(huán)化酶無(wú)法催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)成環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)。環(huán)化酶活性的抑制造成菌體內(nèi)環(huán)腺苷酸的含量降低，從而抑制木質(zhì)糖、阿拉伯糖、鼠李糖、與半乳糖等碳源的穿透酶基因與代謝基因表現(xiàn)，讓菌體無(wú)法代謝此類碳源。此過(guò)程稱為「分解代謝物阻抑(catabolite repression)」。

于具T7表現(xiàn)系統(tǒng)(T7expression system)的大腸桿菌內(nèi)，因分解代謝物阻抑會(huì)抑制表現(xiàn)系統(tǒng)的lac基因操縱組的啟動(dòng)子活性，以間接向下調(diào)控(down regulate)重組蛋白質(zhì)的表現(xiàn)量。為解決此問(wèn)題，J Agric Food Chem.2011；59(12):6534-42已建構(gòu)一株新穎大腸桿菌菌株，命名為BAD5。阿拉伯糖于有氧下能誘導(dǎo)菌株BAD5表現(xiàn)重組蛋白質(zhì)。然而，菌株BAD5無(wú)法有效代謝葡萄糖以外的碳源，故不能產(chǎn)生足夠的能量，以致限制重組蛋白質(zhì)的表現(xiàn)量。申言之，菌株BAD5的重組蛋白質(zhì)表現(xiàn)量無(wú)法滿足業(yè)界需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一構(gòu)想提出一種有氧下可提升重組蛋白質(zhì)表現(xiàn)的菌株，其屬于大腸桿菌，且包含：至少一非內(nèi)源啟動(dòng)子，為可操作地連接至菌株的染色體上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操縱組、及araE基因；一araBAD啟動(dòng)子，為可操作地連接至染色體上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7啟動(dòng)子，為可操作地連接至一重組蛋白質(zhì)基因。而且，菌株缺少araABD基因操縱組、及araFGH基因操縱組。

本發(fā)明的第二構(gòu)想提出一種有氧下可提升重組蛋白質(zhì)表現(xiàn)的菌株，此屬于大腸桿菌，且包含：至少一非內(nèi)源啟動(dòng)子，為可操作地連接至菌株的染色體上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操縱組、araE基因、galP基因、及glk基因；一araBAD啟動(dòng)子，為可操作地連接至染色體上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7啟動(dòng)子，為可操作地連接至一重組蛋白質(zhì)基因。而且，菌株缺少araABD基因操縱組、araFGH基因操縱組、及ptsG基因。

附圖說(shuō)明

圖1說(shuō)明著大腸桿菌的甘油無(wú)氧代謝、甘油有氧代謝、及葡萄糖有氧代謝；圖中符號(hào)說(shuō)明為：活化基因的表現(xiàn)；抑制基因的表現(xiàn)；

圖2為非原態(tài)硫酸十二酯鈉-聚丙烯酰胺電泳圖，以說(shuō)明菌株生產(chǎn)的可溶性蛋白質(zhì)；其中，徑M，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物；徑1，重組菌株BAD5/pChHDT生產(chǎn)的可溶性蛋白質(zhì)；徑2，重組菌株N30/pChHDT生產(chǎn)的可溶性蛋白質(zhì)；箭頭，D-HDT；

圖3顯示菌株N30的液態(tài)培養(yǎng)基于不同時(shí)間培養(yǎng)后的葡萄糖與甘油濃度；

圖4顯示菌株N30-Gal的液態(tài)培養(yǎng)基于不同時(shí)間培養(yǎng)后的葡萄糖與甘油濃度；

圖5為非原態(tài)硫酸十二酯鈉-聚丙烯酰胺電泳圖，以說(shuō)明菌株生產(chǎn)的蛋白質(zhì)；其中，徑M，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物；徑1，重組菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生產(chǎn)的可溶性蛋白質(zhì)；徑2，重組菌株N30(φ80-TrHDT)生產(chǎn)的可溶性蛋白質(zhì)；徑3，重組菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生產(chǎn)的不可溶性蛋白質(zhì)；徑4，重組菌株N30(φ80-TrHDT)生產(chǎn)的不可溶性蛋白質(zhì)；箭頭，融合蛋白質(zhì)TrxA/D-HDT。

具體實(shí)施例