[發明專利]一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201410553158.1
• 申請日: 2014-10-05
• 公開（公告）號: CN104263842A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 李安興;蘇友祿
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/06;C12R1/46
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于細菌檢測技術領域，具體涉及一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

無乳鏈球菌(Streptococcus?agalactiae)，也稱B族鏈球菌，是兼性的革蘭氏陽性球菌，是一種重要的人、獸及魚共患病致病菌。魚源無乳鏈球菌可引起魚類敗血癥和腦膜炎，具有較高的致病率和致死率。現有的魚源無乳鏈球菌的檢測方法主要有常規的細菌分離培養鑒定法、普通PCR檢測法、環介導等溫擴增技術(LAMP)檢測法等。細菌分離培養方法存在耗時和受樣品污染等諸多因素的影響；普通PCR既無法對病原定量，又需要凝膠電泳，容易對環境造成污染；LAMP法雖然靈敏性高，但不能對病原進行定量；而熒光定量PCR技術通過在PCR反應體系中加入可嵌入雙鏈DNA的熒光燃料，利用相應軟件實時監測整個PCR進程中的熒光信號積累情況，對未知模板可進行定性和定量分析，該方法可實時檢測、速度快、高通量、定量準確、靈敏度高、特異性好、自動化程度高，在病原微生物檢測方面已得到廣泛應用，目前，尚無熒光定量PCR方法用于檢測魚源無乳鏈球菌的相關報道。近年來，魚類無乳鏈球菌病大面積爆發流行，該病缺乏有效的治療方法，防止無乳鏈球菌的傳染和流行是當前采取的主要措施，早期快速檢測該病原是減少損失的有效途徑，熒光定量PCR技術應用于水產動物無乳鏈球菌的檢測，對于疾病的預防意義重大。

發明內容

為解決背景技術中的檢測臨床樣品中魚源無乳鏈球菌的問題，本發明提供一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法，該方法可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測出水產養殖動物感染無乳鏈球菌，為防止魚源無乳鏈球菌的傳染和流行提供技術支持。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：

(1)取患病魚的組織50～100mg，稱重后，放入組織勻漿器中研磨，加入1000μL?TE緩沖液，制成組織勻漿液。取組織勻漿液180μL，加入20μL濃度為50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min；后續的提取步驟按照細菌DNA提取試劑盒法的方法進行，即得到高純度細菌基因組DNA，保存于-20℃備用。

(2)根據GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S?rRNA基因間區序列，設計一對特異性引物，序列如下：

上游引物ISR-s：5′GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3′；

下游引物ISR-a：5′AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3′。

(3)使用上述特異性引物擴增出大小為190bp的片段；通過連接、轉化將該片段插入18-T載體；最后對18-T重組質粒進行鑒定。

(4)提取經過測序鑒定正確的重組質粒，應用Thermo?NanoDrop?2000進行質粒濃度檢測，計算出重組質粒的拷貝數，將質粒進行10倍稀釋法稀釋成6.04×10⁸～6.04×10¹拷貝/μL的8個濃度梯度，將其作為標準質粒模板。

(5)將標準質粒作為模板，構建反應體系，進行熒光定量PCR擴增，獲得擴增曲線和標準曲線。

(6)將已經計算出拷貝數的重組質粒進行10倍梯度稀釋，選取6.04×10⁴～6.04×10^-1拷貝/μL的6個濃度梯度，進行熒光定量PCR檢測，以此確定熒光定量PCR所能檢測的最低模板拷貝數，驗證本發明方法的靈敏性。

(7)分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿菌、鰤魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健康斑點叉尾鮰的DNA，以及人DNA標準品為模板，進行熒光定量PCR擴增，驗證本發明方法的特異性。

其中本發明所述步驟5-7中，所述的熒光定量PCR反應體系如下：總反應體積20μL，其中SYBR?Green?I?PCR?Master?Mix預混液(2×)10μL、10μM上、下游引物各0.5μL、模板DNA?1.0μL、無菌水8.0μL；反應程序為：預變性94℃，1min，1個循環；隨后進行40個循環，程序為94℃，30sec，退火60.4℃，20sec，延伸72℃，20sec，同時設溶解曲線反應參數為94，15sec，60℃，30sec，94，15sec。