[發(fā)明專利]一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410553158.1
• 申請日: 2014-10-05
• 公開（公告）號: CN104263842A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設計）人: 李安興;蘇友祿
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/06;C12R1/46
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于其檢測方法的具體步驟如下：

(1)提取魚組織內的無乳鏈球菌DNA，制備檢測液。

(2)引物設計：根據GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S?rRNA基因間區(qū)序列，通過Primer?Premier6.0軟件設計相應的特異性引物，序列如下：

上游引物ISR-s：5′-GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3′；

下游引物ISR-a：5′-AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3′。

(3)標準品模板的制備：使用上述特異性引物擴增出大小為190bp的片段；通過連接、轉化將該片段插入載體；最后對重組質粒進行鑒定。提取經過測序鑒定重組質粒，進行質粒濃度檢測，計算出重組質粒的拷貝數，將質粒進行10倍稀釋法稀釋成6.04×10⁸、6.04×10⁷、6.04×10⁶、6.04×10⁵、6.04×10⁴、6.04×10³、6.04×10²、6.04×10¹拷貝/μL的8個濃度梯度，將其作為標準質粒模板，其中單位體積質粒溶液內的拷貝數計算公式如下：每μL質粒溶液的拷貝數＝[質粒濃度(g/μL)×阿伏伽德羅常數]/[重組質粒分子量×660]。

(4)標準曲線制備：將標準質粒作為模板，構建反應體系，進行熒光定量PCR擴增，獲得擴增曲線和標準曲線。

(5)將已經計算出拷貝數的重組質粒進行10倍梯度稀釋，選取6.04×10⁴、6.04×10³、6.04×10²、6.04×10¹、6.04×10⁰、6.04×10^-1拷貝/μL的6個濃度梯度，進行熒光定量PCR檢測，以此確定熒光定量PCR所能檢測的最低重組質粒拷貝數，驗證本發(fā)明方法的敏感性。

(6)分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿菌、鰤魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健康斑點叉尾鮰的DNA，以及人DNA標準品為模板，進行熒光定量PCR擴增，驗證本發(fā)明方法的特異性。

(7)樣品中的無乳鏈球菌定量計算方法：在熒光定量PCR儀中直接讀取待測樣品的Ct值，將Ct值代入到標準曲線回歸方程式，計算出無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(X)。由于無乳鏈球菌的基因組內含有7個拷貝的ISR序列，則最終樣品中的無乳鏈球菌拷貝數＝X/7。

2.根據權利要求1所述的一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于魚組織內無乳鏈球菌DNA的提取方法為：取病魚的組織50～100mg，稱重后，放入組織織勻漿器中研磨，加入1000μL?TE緩沖液，制成組織勻漿液。取組織勻漿液180μL，加入20μL濃度為50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min后續(xù)的提取步驟按照常規(guī)試劑盒的提取方法進行，即得到高純度的含細菌和魚基因組DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.根據權利要求1所述的一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于步驟4-6中所述的熒光定量PCR反應體系如下：總反應體積20μL，其中SYBR?Green?I?PCR?Master?Mix預混液(2×)10μL、10μM上、下游引物各0.5μL、模板DNA1.0μL、無菌水8.0μL；熒光定量PCR反應程序為：預變性94℃，1min，1個循環(huán)；隨后進行40個循環(huán)，程序為94℃，30sec，退火60.4℃，20sec，延伸72℃，20sec，同時設溶解曲線反應參數為94，15sec，60℃，30sec，94，15sec。