[發(fā)明專利]檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410552602.8
• 申請(qǐng)日: 2014-10-17
• 公開（公告）號(hào): CN105572336A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪霞;邢海龍;戴蔚蔚
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 丹陽億太生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/535;G01N1/28
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• 代理人: 暫無信息

1.檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，包括酶標(biāo)板、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品、吡蟲啉抗體工作液、吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。

2.檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，包括以下步驟：酶標(biāo)板的制備、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品的制備、吡蟲啉抗體工作液的制備、吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其特征在于：所述的酶標(biāo)板制備方法為將吡蟲啉半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到吡蟲啉包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將包被抗原稀釋成1：40000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入稀釋后的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150μL/孔，37℃放置1.5h，棄去封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4℃條件下保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其特征在于：吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其特征在于：所述的吡蟲啉抗體工作液是采用吡蟲啉人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其特征在于：所述的吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，其為0.1mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其為含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。

7.權(quán)利要求2所述的檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法的特征在于：預(yù)處理待測樣品，取包被有吡蟲啉抗原的酶標(biāo)板，按序分別加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液、吡蟲啉抗體工作液各50μL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液充分洗滌4~5次，每次間隔10s，拍干后加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15～20min，加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值（請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中吡蟲啉的含量。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述待測樣品用以下方法進(jìn)行預(yù)處理：a、取20g樣品，經(jīng)組織搗碎勻漿后置于250mL三角瓶內(nèi)；

b、加入40mL丙酮，超聲波提取30min，加入16g無水硫酸鈉，，震蕩渦旋1min；

c、室溫離心4000r/min以上，10min；

d.、取5ml上清液到離心管中，加入5mL二氯甲烷，在密封的容器里混合，震蕩渦旋1min，室溫離心4000r/min以上，10min；

e、取1mL上清液，加入1mL稀釋后的樣品稀釋液充分振蕩混合30s，混勻待測。