[發明專利]檢測吡蟲啉的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201410552602.8
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN105572336A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 洪霞;邢海龍;戴蔚蔚
• 申請（專利權）人: 丹陽億太生物科技發展有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/535;G01N1/28
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技術領域

本發明涉及獸藥殘留檢測技術領域，特別是檢測蔬菜中吡蟲啉的酶聯免疫試劑盒。

背景技術

吡蟲啉（imidacloprid），化學名稱1-（6-氯-3-吡啶基甲基）-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺。吡蟲啉具有廣譜殺蟲活性，對飛虱、蚜蟲、葉蟬等刺吸式口器害蟲有特效，對其他種類的害蟲也有良好的防治效果。吡蟲啉是蔬菜種植過程中常用的農藥，對吡蟲啉殘留檢測成為國家對蔬菜類植物中農藥殘留監控的必要手段。日本規定吡蟲啉在蔬菜中的最高殘留限量（MRL）為0.5mg/kg。

酶聯免疫吸附法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用于食品安全檢測行業。本發明旨在建立一種檢測吡蟲啉的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。

發明內容

為了克服色譜法的不足，本發明提供一種檢測吡蟲啉的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。

本發明檢測吡蟲啉的酶聯免疫試劑盒，包括酶標板、吡蟲啉標準品、吡蟲啉抗體工作液、吡蟲啉酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。

本發明檢測吡蟲啉的酶聯免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標板的制備、吡蟲啉標準品的制備、吡蟲啉抗體工作液的制備、吡蟲啉酶標二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。

其進一步特征在于：所述的酶標板經由吡蟲啉抗原包被制備，具體步驟是將吡蟲啉半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將吡蟲啉包被抗原稀釋成1：40000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶標板甩掉板內液體，加入經稀釋的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標板真空密封于4℃條件下保存。

吡蟲啉標準品濃度分別為0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。

所述吡蟲啉抗體工作液是采用吡蟲啉人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。

所述吡蟲啉酶標二抗工作液由酶標二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5%吐溫-20，0.1mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。

檢測吡蟲啉的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯免疫反應原理，該方法包括以下步驟：

(1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液中；

(2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；

(3)取包被有吡蟲啉抗原的酶標板，加標準品/樣本50μL/孔到對應的微孔中，加入吡蟲啉酶標二抗工作液，50μL/孔，然后加入吡蟲啉抗體工作液，50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環境中反應30min；

(4)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液260μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；

(5)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應15～20min；

(6)加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5min內讀完數據）；

(7)以的標準品濃度(ppb)的對數為橫坐標，標準品百分吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中吡蟲啉的含量。

其中，所述待測樣品用以下方法進行預處理：

a、取20g樣品，經組織搗碎勻漿后置于250mL三角瓶內；