[發(fā)明專利]一種開發(fā)基因組SSR分子標記的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410550682.3
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104313146A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設計）人: 劉宇婧;郭鈺;龍春林;吳沿友;付為國;邢德科;張川
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 江蘇縱聯(lián)律師事務所 32253
• 代理人: 蔡棟

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種關于基因組測序文庫中的SSR分子標記開發(fā)的技術。

背景技術

DNA分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。與常規(guī)的形態(tài)標記、細胞學標記和生化標記三類遺傳標記技術相比，DNA分子標記直接具有如下優(yōu)勢：(1)以DNA的形式存在于動植物的任何生長階段，任何組織都可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境的限制，不存在表達與否的問題；(2)數(shù)量極多，基因組變異極其豐富，標記的數(shù)量幾乎是無限的，多態(tài)性高，利用大量引物、探針可完成覆蓋基因組的分析；(3)許多標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利，能夠鑒別出純合的基因型與雜合的基因型，提供完整的遺傳信息。由于以上的特點，DNA分子標記發(fā)展成目前應用最廣泛的分子標記。

SSR是Simple?Sequence?Repeats的縮寫，即簡單序列重復，亦稱微衛(wèi)星序列，是近年來發(fā)展起來的建立在PCR基礎上的第二代分子標記。SSR由1-6個核苷酸不斷重復構成，同一類SSR可分布于整個基因組的不同位置上，每個座位上重復單位的數(shù)目存在差異，因而造成了每個座位上的多態(tài)性。微衛(wèi)星在原核生物和真核生物基因組中隨機分布，而且該標記呈共顯性，符合孟德爾遺傳模式，易于操作，具有高度重復性和可靠性，顯示出較強的多態(tài)性等優(yōu)點，使其在遺傳連鎖圖譜構建、基因定位與輔助選擇育種、系譜與進化關系研究、種質資源鑒定、遺傳多樣性等研究領域有重要應用，因此SSR被認為是目前最好的分子標記之一。

目前SSR的開發(fā)策略可以分成兩大類，首先第一類是利用現(xiàn)有數(shù)據庫開發(fā)SSR。在Genebank等數(shù)據庫中，含有許多物種的基因組序列及EST序列信息，通過這些序列就可以方便地通過SSR搜素軟件獲得SSR。但是對于地球上存在的龐大的物種來說，目前數(shù)據庫中許多物種基因組DNA信息及其EST序列還非常有限或者根本沒有，這使得第一類方法的適用性并不是很廣泛。第二類是通過建立DNA文庫，然后對文庫測序，進行SSR開發(fā)，這類策略可適用于所有未知基因組DNA或EST序列的物種，主要包括如下三種方式：

(1)常規(guī)Sanger法，包括如下步驟：DNA提取、SSR富集、構建TA克隆文庫、質粒提取、Sanger測序、引物設計、篩選多態(tài)位點；

(2)二代測序法(需要富集)，包括如下步驟：DNA提取、SSR序列富集、構建二代測序文庫、二代測序、組裝、尋找SSR、引物設計、篩選多態(tài)位點；

(3)二代測序法(不需要富集)，包括如下步驟：DNA提取、構建二代測序文庫、二代測序、組裝、尋找SSR、引物設計、篩選多態(tài)位點。

Sanger法是單個片段序列測定，要構建大量的TA克隆文庫，所以很耗費時間以及人力，因此遠不如后兩種使用二代測序的方法來的便捷。SSR按照重復單元堿基來分類，可以分為單堿基重復(共4¹種)，二堿基重復(共4²種)，三堿基重復(共4³種)，四堿基重復(共4⁴種)等等，只計算單、雙、三堿基重復的SSR種類數(shù)就達4¹+4²+4³＝84種之多，而富集SSR的策略是通過探針雜交來進行的，而探針的種類又不可能設計那么多，而往往設計幾種即可，這樣便只能得到幾種SSR，因此，富集SSR的種類和數(shù)目上都遠比不上不富集SSR的文庫，表1列出了文章中出現(xiàn)的通過二代測序法開發(fā)SSR的利用情況。綜合考慮，使用二代測序法，且不做SSR富集，直接建庫測序開發(fā)SSR的方法最為優(yōu)良。目前二代測序使用最多的就是454測序技術和Illumina測序技術，454測序技術采用的是磷酸測序法，Illumina測序技術采用的是可逆終止法的邊合成邊測序技術；相對于454測序技術，Illumina測序技術可以更低廉的價格獲得基因組序列；但是，目前通過二代測序法(不需要富集)開發(fā)基因組SSR，利用的是454測序技術，而對于Illumina測序技術，還未見報道開發(fā)基因組SSR，只有開發(fā)轉錄本SSR，如表1所示。這是因為，利用454測序技術，可得到的Reads數(shù)目平均讀長為500bp，可以在這些Reads中直接進行SSR尋找。

表1?目前二代測序法開發(fā)SSR分子標記的情況