[發明專利]一種培育高抗TYLCV番茄的方法

有效

• 申請號: 201410547125.6
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104313051A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 孫勝;邢國明;邢曉娟;亢秀萍;陳志峰;李興桃;許小勇
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵;崔兆慧

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種培育高抗TYLCV番茄的方法。

背景技術

番茄黃化曲葉病毒(Tomato?yellow?leaf?curl?virus,TYLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，是植物病毒中唯一一類具有孿生顆粒形態的單鏈環狀DNA(single?stranded?DNA,ssDNA)病毒。TYLCV基因組編碼六個ORF：在病毒鏈上的AV1和AV2，在互補鏈上的AC1、AC2、AC3和AC4。AV1編碼的是病毒的外殼蛋白(coat?protein,CP)，與病毒的包殼、介體傳播及與寄主互作相關；AV2編碼是移動蛋白(move?protein,MP)相關的蛋白，主要起到協助移動蛋白的功能；AC1編碼病毒復制相關蛋白(replication-associated?protein,Rep)，參與病毒基因組DNA的復制起始；AC2編碼的蛋白是一個轉錄激活子(transcriptional?activator,TrA)，該蛋白能激活DNA-A和DNA-B病毒鏈上的基因轉錄；AC3編碼一個復制增強蛋白(replication?enhancer?protein,REn)，但對病毒侵染力不起決定作用)；AC4編碼的蛋白參與病毒的復制或轉錄調控。

TYLCV病發病癥狀主要表現為：頂端葉片邊緣黃化且上卷，葉脈間葉肉發黃，植株上部葉片變小，整個葉片萎縮，褶皺，植株生長變緩或停滯，節間縮短，明顯矮化，致使產量和質量降低。1991年，我國首次在廣西南寧發現該病毒。從2006年起，該病毒在北京、山西、江蘇、上海、廣東、廣西、云南等地相繼發現，并對當地的番茄生產造成了巨大的損失。

預防為主、防治結合是防治番茄黃化曲葉病毒病的主要原則，目前主要通過調整栽培結構、防治煙粉虱、加強田間管理以及選用抗病品種等措施對該病進行綜合防治。但這些方法成本高、效果不夠理想，有時甚至會給環境帶來負面影響，而進行抗病品種選育是最有效的途徑之一。在TYLCV的抗病性育種方面，國外研究的比較早，目前國外一些國家的科研人員已經以野生抗病番茄品系為材料，通過雜交選育和基因工程得到了一些抗病或耐病的商業品種。

但傳統的雜交育種艱苦費時，從而大大限制了育種工作的進展。與之相比，基因工程育種具有明顯的優越性：1)育種周期短；2)適用范圍廣，尤其適用于傳統育種因缺乏抗原而難以進行的抗CMV育種；3)在育種過程中不會引入其它不良農藝性狀的基因等。因此，基因工程在番茄抗病毒病育種中的應用日益受到人們的重視。當前，番茄抗病毒病基因工程主要采用轉病毒外殼蛋白(CP)基因的方法，獲得了轉煙草花葉病毒外殼蛋白基因番茄，培育出了能穩定遺傳的抗病毒植株。除病毒的外殼蛋白基因外，目前在番茄上主要采用衛星RNA、反義RNA以及RNAi等方法獲得不同程度的抗病毒番茄。

目前，轉基因的大部分的注意力都集中于單個的AC1蛋白、AV1蛋白或干擾TYLCV在番茄內的復制、轉移的其它蛋白基因。這種轉基因的方法獲得的高抗轉基因植物的幾率較小，且該策略還存在異源重組等生態安全性的問題。RNA沉默機制的發現和應用，為抗病毒基因工程提供了新的途徑，該方面的研究在國際、國內已經廣泛深入進行。但是，所有抗TYLCV的商業雜交種均為單個抗性基因導入，當TYLCV大規模發生時，它們的抗病能力有限甚至下降，仍會造成嚴重的經濟損失。為保障我國番茄產業可持續發展，促進菜農增產增收，進行更高抗TYLCV的番茄新品種的研究選育工作刻不容緩。

有研究表明，通過聚合不同抗源的基因以提高植物對多種病毒的抗性是提高一個品種抗病能力的重要策略之一。2005年，白慶榮等在煙草中轉入PVX-CP和PVY-CP嵌合基因并獲得了6株對兩種病毒免疫的轉基因株系；2008年，朱常香等獲得了同時對PVY、TMV和CMV這3種病毒都有抗性的煙草；2011年，牛顏冰等獲得同時對兩種病毒(TMV和CMV)免疫的轉基因煙草；至今為止，國內外尚未有關利用基因技術聚合同一抗源的不同基因來提高植物對特定病毒高抗性的研究報道，因此進行高抗TYLCV番茄新品系的多嵌合基因沉默技術及相關研究具有重大意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種培育高抗TYLCV番茄的方法，針對目前TYLCV對番茄的產量和質量的嚴重危害，采用基因瞬時表達來快速篩選并培育對TYLCV具有高抗性的高抗TYLCV番茄，大大縮短篩選周期。

為了達到上述目的，本發明的技術方案如下：

一種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟：