[發(fā)明專利]一種培育高抗TYLCV番茄的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410547125.6
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104313051A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫勝;邢國明;邢曉娟;亢秀萍;陳志峰;李興桃;許小勇
• 申請（專利權(quán)）人: 山西農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 上海開祺知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵;崔兆慧

1.一種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟：

1)將TYLCV的AV1基因片段、AC1基因片段和AC3基因片段嵌合得到多基因嵌合體AV1-AC1-AC3，并構(gòu)建反向重復序列的RNAi載體；其中，AV1、AC1和AC3基因片段的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.1，SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3所示，多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；

2)利用農(nóng)桿菌介導法將RNAi載體在番茄上瞬時表達得到轉(zhuǎn)化多基因嵌合體AV1-AC1-AC3的轉(zhuǎn)基因番茄；

3)轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)過TYLCV系統(tǒng)性侵染、鑒定抗病性，獲取對TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。

2.一種培育高抗TYLCV番茄的方法，包括如下步驟：

1)以感病番茄中提取的總DNA為模板，利用三對引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/AC3R分別進行PCR擴增AV1基因片段，AC1基因片段和AC3基因片段，所述AV1、AC1和AC3基因片段的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3所示；引物AV1F/AV1R，AC1F/AC1R和AC3F/AC3R的序列具體為：

AV1F：CGCGGATCCGAGCTCATTCGTCTTAACAC

AV1R：ATATTTATTAAAATCATAGAAA

AC1F：TATTTAAATACTTTAATTTGAA

AC1R：GCTCTAGAGCGGCCGCGATCTGAGTCC

AC3F：TTTCTATGATTTTAATAAATAT

AC3R：TTCAAATTAAAGTATTTAAATA

2)將PCR產(chǎn)物混合，以引物AV1F和AC1R進行PCR擴增，得到多基因嵌合體AV1-AC1-AC3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。多基因嵌合體AV1-AC1-AC3與載體pGEM-T?Easy?Vector連接，得到質(zhì)粒pGEM-T-AV1-AC1-AC3；

3)使用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI雙酶切質(zhì)粒pGEM-T-AV1-AC1-AC3和克隆載體pBluescript?II?SK(-)-RTM1，將酶切片段和載體進行連接，得到重組質(zhì)粒pBluescript?II?SK(-)-AV1-AC1-AC3-RTM1；

4)使用限制性內(nèi)切酶SacI和NotI雙酶切質(zhì)粒pBluescript?II?SK(-)-AV1-AC1-AC3-RTM1和質(zhì)粒pGEM-T-AV1-AC1-AC3，將酶切片段和載體進行連接，得到重組質(zhì)粒pBluescript?II?SK(-)-AV1-AC1-AC3(i/r)；

5)將構(gòu)建的干擾片段AV1-AC1-AC3從重組質(zhì)粒pBluescript?II?SK(-)-AV1-AC1-AC3(i/r)上使用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI雙酶切切下，并連接到植物表達載體pBIN19上，構(gòu)建RNAi載體pBIN19-AV1-AC1-AC3(i/r)；

6)通過農(nóng)桿菌介導法將RNAi載體pBIN19-AV1-AC1-AC3(i/r)注射到番茄幼苗，再用含有TYLCV侵染質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染番茄植株，將TYLCV基因組導入番茄植株內(nèi)；通過提取番茄DNA、斑點雜交檢測TYLCV含量來篩選出對TYLCV具有抗性的高抗TYLCV番茄。

3.如權(quán)利要求1或2所述的培育高抗TYLCV番茄的方法在提高番茄抗TYLCV中的應用。