[發明專利]一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法

有效

• 申請號: 201410546445.X
• 申請日: 2014-10-16
• 公開（公告）號: CN104316688A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 匡華;孔德昭;胥傳來;徐麗廣;馬偉;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法，屬于免疫分析技術領域。?

背景技術

水稻細菌性條斑病菌，學名：Xanthomonas?oryzae?pv.oryzicola（Xooc），英文名bacterial?leaf?streak?of?rice，屬于黃單胞菌目，黃單胞菌科，黃單胞菌屬。水稻細菌性條斑病于1918年首次發現于菲律賓，目前在東南亞各國和非洲中部都有發生，我國主要發生在南方水稻產區。水稻細菌性條斑病菌主要危害水稻葉片，在秧苗期即可出現典型的條斑型癥狀，其發生具有流行性、爆發性和毀滅性的特點。水稻細菌性條斑病菌通過侵染種子，借種子調運而遠距離傳播。因此很多國家和地區已將其列為檢疫性細菌，并限制從疫區進口水稻種子。我國也將其作為水稻上的檢疫性病害之一。?

對水稻細菌性條斑病菌的傳統檢測技術包括產地檢疫、育苗生長觀察法、分離法、噬菌體檢測等，耗時長，且檢測結果存在不可靠性。PCR檢測方法快速、準確、靈敏，但是技術條件高，設備昂貴，普及推廣受到很大限制。血清學檢測技術靈敏、快速，如果獲得高質量的抗血清或抗體，對于大批量樣品的粗篩檢測十分適宜。?

由于對水稻細菌性條斑病菌目前在農業生產上還沒有有效的防治方法，并且種子帶菌是該病重要的初侵染來源和傳播途徑，因此，及早檢測發現種子上的病原菌對于預防該病并采取相應防治措施，指導生產和減少經濟損失有重要意義。所以，建立水稻細菌性條斑病菌的有效而且便捷快速的檢測方法有利于水稻病害的檢疫，對出入境和國內病源地區水稻種子的檢疫工作顯得尤為重要。而ELISA方法憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點成為致病菌的常規檢測方法。抗體的親和力、交叉反應、穩定性對于ELISA方法的靈敏度和特異性有著關鍵性的決定作用。?

因此，本發明制備了高靈敏的水稻細菌性條斑病菌的單克隆抗體并以此為基礎建立了雙抗體夾心ELISA法，為水稻種子中水稻細菌性條斑病菌的大批量、快速、準確的檢測奠定基礎。?

發明內容

本發明的目的在于建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯免疫吸附檢測方法，用于水稻種子中水稻細菌性條斑病菌的大批量、快速、準確檢測。?

本發明的技術方案，本發明建立了一種食品中水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心檢測方法，該方法包括對檢測方法的優化。?

一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法，步驟為：?

（1）水稻細菌性條斑病菌單克隆抗體的制備：

以水稻細菌性條斑病菌NCPPB?1150菌體（來自湖南省進出口檢驗檢疫局）

做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠；免疫程序如下：第一周進行首免，1×10⁸cfu水稻細菌性條斑病菌菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第四周進行二免，1×10⁷cfu水稻細菌性條斑病菌菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第六周進行三免，1×10^7?cfu水稻細菌性條斑病菌菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；

第七周尾部采血測效價，分別挑選對水稻細菌性條斑病菌菌體效價最高的老鼠；第九周進行沖刺免疫，1×10⁷cfu水稻細菌性條斑病菌菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進行融合、篩選，共篩選到7個細胞株；

（2）單克隆抗體的配對篩選：

將純化后的7株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標記成功后進行夾心法配對；配對參數如下：包被抗體2μg/mL；包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩沖液；標品濃度1×10⁸cfu/mL；標品稀釋液0.01M、pH7.2的PBS；酶標抗體稀釋500倍使用；在此條件下，實驗成功得到了6對P/N值>5的配對；

（3）夾心法的建立：選擇檢測限穩定、靈敏的配對，即以3D7（單克隆細胞株J號）為包被抗體，4H6（單克隆細胞株K號）作為酶標抗體建立夾心法；具體參數如下：

包被抗體濃度：2μg/mL；包被液：0.01M、pH9.6碳酸鹽緩沖液；標品稀釋液：0.01M、pH7.2?PBS+0.2%Tween；酶標抗體濃度：2.5μg/mL；

反應時間：包被抗體：封閉37℃，反應2h；標準品：37℃，反應1h；酶標抗體37℃，反應1h；顯色時間10min，即可。