[發明專利]增強酮古龍酸菌碳代謝水平提高產2-酮基-L-古龍酸能力的方法

在審

• 申請號: 201410545705.1
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104357529A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 張怡軒;付陽;于哲;張盛;李野;韓立濤;張海宏
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P7/60;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 靳玲

技術領域:

本發明屬于微生物發酵領域，涉及一種通過對微生物碳源組成的選擇與優化，使酮古龍酸菌產2-KGA(2-酮基-L-古龍酸)能力提高的方法，以及改造維生素C發酵工藝。

背景技術：

維生素C(VC)是人體必需的一種維生素，在抗氧化和維持新陳代謝平衡等方面具有廣泛的生理作用，在醫藥工業、食品工業、飼料行業以及化妝品行業上均有重要用途。其應用范圍廣闊，市場規模巨大。

目前，全球90％以上的VC生產，均利用我國發明的“二步發酵法”。其第一步發酵是在氧化葡萄糖酸桿菌作用下將D-山梨醇氧化為L-山梨糖。第二步是在一種混合菌系的作用下將L-山梨糖進一步氧化成VC的重要中間體2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)。最后經過化學轉化使2-KGA生成VC。

“二步發酵法”的主要特點是在第二步發酵過程中，由于芽孢桿菌Bacillus?sp.(俗稱大菌)的伴生作用，酮古龍酸菌Ketogulonigenium?sp.(俗稱小菌)的生長和2-KGA的產率得到很大提高，但大菌沒有任何產生2-KGA的能力，其主要作用是輔助小菌生長。故小菌作為2-KGA產生菌，對其代謝能力的增強一直是學者們的研究熱點。

本發明前期通過對混菌培養種液培養基及發酵培養基營養成份的考察發現，其主要碳源為L-山梨糖，L-山梨糖即作為碳源被小菌自身生長代謝所需，又作為合成2-KGA的底物，而大菌則不能利用L-山梨糖作為碳源，主要是利用玉米漿中存在的少量碳源滿足自身生長所需。故在實際發酵過程中，一方面由于小菌直接利用底物L-山梨糖作為碳源，導致產物2-KGA轉化率降低，另一方面由于培養基中碳源種類單一，限制了菌體生長的數量與代謝能力，故亦直接影響了產2-KGA的發酵速率。

本發明分別是建立在對大小菌全基因組的測序與功能注釋的基礎上，通過對大小菌糖代謝網絡的分析，發現并驗證了一批可以在混菌發酵過程中，被小菌很好利用并具有促進菌體生長，提高發酵效率的廉價碳源，包括：二碳單位如乙醇、乙醛及乙酸(鹽)及六碳單位如D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖。

本發明公開前，未見有將上述碳源應用在維生素C二步發酵混菌發酵的報道和專利。

發明內容：

本發明的目的在于利用廉價的除L-山梨糖外的小菌可利用的碳源，添加到常規種液或發酵液中，用以提高2-KGA收率、降低發酵周期。

實際上，本發明涉及一種通過對微生物碳源組成的選擇與優化，使酮古龍酸菌產2-KGA能力提高的方法以及工藝。

進一步說，上述的碳源組成包括：二碳單位碳源、六碳單位碳源中的一種或幾種，具體地，所述的碳源包括乙醇、乙醛、乙酸(鹽)、D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖中的一種或幾種。

本發明還提供了用于制備種液的培養基及用于發酵的培養基，該培養基包括制備種液及發酵液的常規培養基，其特征在于：培養基包括所述碳源中的至少一種物質，所述碳源物質在培養基中出現的方式包括直接加入也包括以其它混合物形式加入。

上述培養基中，所述各碳源物質加入量為0.02％-2％。當添加量低于下限，對混菌發酵促進作用不明顯，當添加量高于上限時，或對菌體生長不利，或產2-KGA減少，或造成原料的浪費。

上述常規培養基一般來講，既為目前VC二步發酵工業生產中使用的培養基，具體由下列成份組成：

1.常規種液培養基：1-3％L-山梨糖，0.3-1％玉米漿，0.1-0.5％葡萄糖，0.05-0.3％尿素，0.1-0.3％碳酸鈣，pH?6.7-7.0，121℃滅菌20min。

2.常規發酵培養基：8-12％L-山梨糖、0.3-3％玉米漿、0.05-0.2％磷酸二氫鉀,0.05-0.5％尿素，0.005-0.02％硫酸鎂，0.1-0.5％碳酸鈣，pH6.7-7.0，其中碳源(L-山梨糖)和氮源分開滅菌，滅菌條件為121℃，20min。

在種液培養基及發酵培養基中加入上述至少一種二碳及六碳單位是本發明的重點。這些物質既可以在培養基配制的時候添加，也可以在發酵開始后以補料方式加入。

本發明的技術方案見實施例。

實驗發現，在常規種液中單獨或者復合添加二碳或六碳單位碳源，能明顯提高種液中大小菌的數量，并在進一步的發酵過程中降低發酵周期，但轉化率提升不大。在常規發酵液中單獨或者復合添加二碳或六碳單位碳源亦可提高大小菌數量，并在降低發酵周期的同時，明顯提高2-KGA轉化率。