[發(fā)明專利]一種高效提取無菌木瓜蛋白酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410544148.1
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104293750A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊剛柱;徐小琴;萇釗;張衛(wèi)剛;閻巖;楊立琛
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50
• 代理公司: 西安億諾專利代理有限公司 61220
• 代理人: 韓素蘭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蛋白酶的提取純化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

木瓜蛋白酶廣泛地存在于番木瓜的根、莖、葉和果實(shí)內(nèi)，其中在未成熟果實(shí)的乳汁中含量最是豐富。木瓜蛋白酶具有適用溫度、酸堿度范圍廣、反應(yīng)活性強(qiáng)、產(chǎn)品穩(wěn)定性好等特征，因此在醫(yī)藥、食品、飲料、化學(xué)試劑、飼料、紡織化妝品等方面都有廣泛的應(yīng)用，是植物蛋白酶類產(chǎn)品中使用量和使用領(lǐng)域最大最廣泛的酶之一。

目前提取木瓜蛋白酶的方法較多，如超濾法、鹽析法、有機(jī)溶劑法、親和層析法等。鹽析法設(shè)備要求低、操作簡單，但產(chǎn)品雜質(zhì)尤其是鹽含量偏高，產(chǎn)品活性較低，無法在有較高活力和純度要求的領(lǐng)域應(yīng)用，如醫(yī)藥；有機(jī)溶劑法存在工藝復(fù)雜、物料消耗大和溶劑殘留高的問題；親和層析法能獲得較高純度和活性的木瓜蛋白酶產(chǎn)品，但設(shè)備要求高，同時(shí)難以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。因此，當(dāng)前的主流生產(chǎn)工藝為超濾法，該法設(shè)備要求高，但工藝簡單、不會(huì)引進(jìn)別的化學(xué)物質(zhì)，產(chǎn)品活性好、純度高。

超濾法的一般工藝流程為：木瓜乳汁→膠體磨磨漿→固液分離→微濾→超濾→凍干→粉碎包裝。利用此法能獲得酶活為250萬U/g左右的木瓜蛋白酶產(chǎn)品。但該法存在兩方面的缺陷，第一，由于膠體磨本身的特點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)處理大量原料時(shí)，容易造成料液溫度過高，極大影響產(chǎn)品的酶活；第二，在微濾之后采用單分子量截留超濾，實(shí)際上去除的只是小分子鹽和少部分有機(jī)雜質(zhì)，起到的總效果僅僅和濃縮相當(dāng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種高效提取無菌木瓜蛋白酶的方法，它在提高提取率的同時(shí)還能保證蛋白酶的酶活性。

膠體磨處理木瓜漿降低酶活是因?yàn)樘幚砹看?，長時(shí)間工作造成料液溫度過高而引起的，本發(fā)明第一步就進(jìn)行固液分離，得到的固相再進(jìn)入膠體磨，這樣，由于處理量小溫度不會(huì)升的過高，同時(shí)液相部分不用進(jìn)入膠體磨，本身酶活性保持較好，膠體磨負(fù)荷極大降低。

本發(fā)明所述的一種高效提取無菌木瓜蛋白酶的方法，包括下述步驟：

a.新鮮木瓜割漿，按其質(zhì)量比1：1-0.5加入水，攪拌混勻后得到漿液；

c.將漿液離心分離，分離出上清液，并得到木瓜漿殘?jiān)?/p>

d.木瓜漿殘?jiān)促|(zhì)量比1：1加入水，攪拌均勻后用膠體磨打磨乳化，乳化液離心分離，取上清液與步驟c獲得的上清液混合

e.將混合液先微濾，再超濾，最后經(jīng)冷凍干燥后粉碎即可。

優(yōu)選地，步驟c在離心分離前先對漿液進(jìn)行打漿。

所述的打漿是指將漿液粉碎攪拌均勻，其中粉碎可以用目前任意粉碎機(jī)將上述的加水木瓜漿粉碎，達(dá)到打細(xì)就可以。其中粗細(xì)沒有嚴(yán)格限制。

或者優(yōu)選地，步驟a和步驟c之間還有步驟

b.向漿液中添加抑菌劑、還原劑和金屬離子鰲合劑。

或者優(yōu)選地，步驟e所述的微濾是指采用0.2微米陶瓷膜進(jìn)行微濾。

或者優(yōu)選地，步驟e所述的超濾是指先經(jīng)過50KDa中空纖維超濾膜進(jìn)行一次超濾，再經(jīng)過5KDa中空纖維超濾膜進(jìn)行二次超濾。

本發(fā)明在膠體磨前先進(jìn)行固液分離，只有固相進(jìn)入膠體磨，極大減少處理量，有效降低打磨過程中的溫度，在提高提取率的同時(shí)有效保證蛋白酶的酶活性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.?先對原料打漿處理，離心分離后，上清液中活性收率為70%左右；

2.?上述離心處理的固相殘?jiān)?，質(zhì)量為原料質(zhì)量的23%左右，膠體磨處理時(shí)，負(fù)荷減少約80%，處理液溫度能較好控制，從而減少高溫造成的酶活下降；

3.?采用膠體磨處理的殘?jiān)?jīng)加水、攪拌后離心分離，產(chǎn)品酶活占原料總酶活24%以上，因此采用該工藝，膜處理之前，原料中酶活總提取率約為94%；

4.?微濾采用0.22微米陶瓷膜，初步去除較大雜質(zhì)，使后續(xù)超濾工藝更高效；

5.?超濾采用兩級處理，總收率在95%以上：

50KDa超濾步驟，一方面完全去除水體中的微生物，保證產(chǎn)品的微生物指標(biāo)完全滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，另一方面，截留高于其截留分子量的生物大分子，包括多糖、核酸和雜質(zhì)蛋白；

5KDa超濾步驟則能去除小分子雜質(zhì)，包括寡糖、寡肽、氨基酸等和無機(jī)鹽類，同時(shí)通過這一步的濃縮特性，后續(xù)凍干步驟地負(fù)荷也能極大減小；

6.最終產(chǎn)品酶活在330萬U/g以上，總收率約為85%。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

a.新鮮木瓜割漿，向100公斤漿中加入80公斤水，得到漿液；

b.向漿液中添加抑菌劑、還原劑和金屬離子鰲合劑；