[發明專利]一株金龜子綠僵菌轉基因菌株及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410542584.5
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN104357475A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 張凡;廖慧萍;張潔;劉新;祝金寶;盧敏
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪;崔苗苗

技術領域

本發明涉及一株金龜子綠僵菌轉基因菌株及其制備方法與應用，具體的涉及一種含有外源類枯草桿菌蛋白酶基因，經基因重組得到的金龜子綠僵菌及其制備方法與應用。

背景技術

德國小蠊，俗稱蟑螂，是常見的世界性衛生害蟲之一，能夠攜帶多種細菌、病毒及寄生蟲卵，導致疾病的傳播，其分泌物或死亡蟲體還能導致嚴重的機體過敏。自傳入國內以來，因其對棲息場所的適應性強、繁殖快，易對化學殺蟲劑產生耐藥性，對我國的侵害程度日趨嚴重。

目前，對德國小蠊的防治仍以化學防治為主，但高毒、高殘留的化學殺蟲劑的長期大量使用引起了一系列的環境和食品安全問題，因此減少化學殺蟲劑的使用勢在必行，以生物防治為主的害蟲防治策略逐漸受到廣泛的重視。生物防治具有對人畜的安全性高，無公害，無殘留，有利于保持生態平衡和環保等優點，而被認為是對付高抗害蟲的最有前途的技術手段。

金龜子綠僵菌(Metarhizium?anisopliae)，屬于半知菌亞門綠僵菌屬，是一種昆蟲內寄生菌物。它對寄主的侵染過程包括粘附、孢子萌發、穿透蟲體、體內發育和致死，這一過程是附著胞、表皮降解酶和破壞菌素等物質的生理生化作用的綜合結果，該菌通過體壁接觸感染導致害蟲死亡，在侵染昆蟲體壁過程中分泌一系列的胞外水解酶如蛋白酶，幾丁質酶等，降解昆蟲體壁引起昆蟲致病并死亡，其中研究最多的是胞外蛋白酶系。金龜子綠僵菌產生的胞外蛋白酶在入侵寄主體壁的過程中起重要作用，其產生水平和活性高低是決定金龜子綠僵菌侵染能力的重要因素。

類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-like?protease?A，Prla)是胞外蛋白酶的一類，在降解昆蟲體壁，并激活昆蟲自毒免疫體系，引起害蟲致病作用中起主要作用，已被證明是重要的致病因子。已有研究證實，組成性表達在穿透昆蟲體壁過程中起重要作用的Pr1a類蛋白酶基因Pr1a顯著提高了金龜子綠僵菌對煙草天蛾的毒力。

自1973年Mishra和Tatum首次報道肌醇缺陷型粗糙鏈孢霉的DNA轉化以來，絲狀真菌遺傳轉化研究發展非常迅速，目前已有100多種絲狀真菌實現了轉化。轉化方法包括CaCl₂-PEG轉化法，基因槍法，電激轉化法及農桿菌介導轉化法(ATMT)等。其中，CaCl₂-PEG轉化法以原生質體作為受體細胞，具有群體數量大、容易獲得純合性的轉化子等優點，近年來在病原真菌的遺傳轉化中得到廣泛應用。Bogo等通過PEG轉化法，將帶有苯菌靈抗性的質粒pBT6導入金龜子綠僵菌，轉化率為0.8～6.9個轉化子/μg?DNA。Inglis等同樣利用PEG介導轉化法將pBT6質粒導入玫煙色擬青霉和淡紫擬青霉中。Sandhu等采用PEG介導法，成功的進行了白僵菌的遺傳轉化，線性和圓形的質粒Psv50的轉化率分別為4和6個轉化子/μgDNA。

在德國小蠊生物防治的過程中，以昆蟲病原真菌-綠僵菌ESC-1為主要成分的滅蟑盒(Biopath毒餌)較為成功，在實際應用中也取得了一定的效果，但昆蟲病原真菌殺蟲劑滅殺效果通常較慢，毒力較弱，難以短時間內實現對德國小蠊種群的有效控制。

發明內容

本發明的目的是提供一種對德國小蠊滅殺效果好，毒力較強，能夠在短時間內實現對德國小蠊種群有效控制的金龜子綠僵菌轉基因菌株。該金龜子綠僵菌轉基因菌株以金龜子綠僵菌為基礎，利用Pgpd作為強啟動子，TTrpC作為終止子，Basta作為篩選標記，利用融合PCR的方法構建類枯草桿菌蛋白酶Pr1a過表達盒，然后制備真菌原生質體，利用CaCl₂-PEG介導法進行基因工程改造，將過表達盒隨機插入金龜子綠僵菌基因組中，進行過表達，進一步增強其對德國小蠊的滅殺效果。

本發明的另一目的是提供該金龜子綠僵菌轉基因菌株在防治德國小蠊中的應用。

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

一株金龜子綠僵菌轉基因菌株，由金龜子綠僵菌基因與外源類枯草桿菌蛋白酶Pr1a基因融合構建的重組工程菌。

具體的，上述金龜子綠僵菌轉基因菌株的構建方法如下：

(1)根據GenBank上登錄號為EU526905的類枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，設計PCR引物，引物序列如下：

5'-aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO?1所示；