[發明專利]一株金龜子綠僵菌轉基因菌株及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410542584.5
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN104357475A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 張凡;廖慧萍;張潔;劉新;祝金寶;盧敏
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪;崔苗苗

1.一株金龜子綠僵菌轉基因菌株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)根據GenBank上登錄號為EU526905的類枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，設計PCR引物，引物序列如下：

5'-aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO?1所示；

5'-ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3'，如序列表中SEQ.ID.NO?2所示；

根據上述引物序列，以金龜子綠僵菌菌株基因組DNA為模板，擴增出Pr1a基因片段，序列片段如序列表中SEQ.ID.NO?3所示；

(2)利用Pgpd作為強的啟動子，TTrpC作為終止子，Basta作為篩選標記，利用融合PCR的方法構建過表達盒。

(3)采用二級培養法收集金龜子綠僵菌菌絲體，制備金龜子綠僵菌濕菌絲原生質體；

(4)將步驟(2)制備的過表達盒采用CaCl₂-PEG介導法導入到步驟(3)制備的金龜子綠僵菌原生質體中，將過表達盒隨機插入金龜子綠僵菌基因組中，進行過表達；

(5)篩選分離basta抗性能夠穩定遺傳的金龜子綠僵菌重組菌株。

2.如權利要求1所述的金龜子綠僵菌轉基因菌株的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，用于擴增Pgpd啟動子的引物序列為：

M1號引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO?4所示；

M2號引物：AGAAGAGCAGACAGATGCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAGA，如序列表中SEQ.ID.NO?5所示；

用于擴增TTrpC終止子的引物序列為：

M5號引物：ACAACGGCAACGGTGCCTAAGATCCACTTAACGTTACTGA，如序列表中SEQ.ID.NO?8所示；

M6號引物：CAGTTCTTCTCGGCGTTAACCCAGGGGCTGGTGACGG，如序列表中SEQ.ID.NO?9所示。

3.如權利要求1所述的金龜子綠僵菌轉基因菌株的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，構建的過表達盒的全長序列如序列表中SEQ.ID.NO?15所示。

4.如權利要求1所述的金龜子綠僵菌轉基因菌株的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，金龜子綠僵菌原生質體的制備方法為：以0.7mol/L的NaCI溶液作為滲透壓穩定劑，20mL原生質體Buffer，30℃酶解處理5小時。

5.權利要求1至4任一項所述的方法制備的金龜子綠僵菌轉基因菌株。

6.權利要求5所述的金龜子綠僵菌轉基因菌株在制備防治德國小蠊的生物防治材料中的應用。

7.一種用于德國小蠊生物防治的菌劑，其特征在于，由權利要求1所述的金龜子綠僵菌轉基因菌株經固體發酵法制得。

8.如權利要求7所述的用于德國小蠊生物防治的菌劑，其特征在于，發酵培養條件為：發酵溫度為26-28℃，初始pH值為5.5-6.5，發酵周期12-15天。