[發(fā)明專利]一種酮還原酶及其在不對(duì)稱合成手性羥基化合物中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410541899.8
• 申請(qǐng)日: 2014-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN105567652B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅煜;丁時(shí)澄;瞿旭東;王海濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海弈柯萊生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 于永進(jìn)

本發(fā)明提供了一種催化活性高、對(duì)映選擇性強(qiáng)、底物耐受性好的酮還原酶，以及使用該酮還原酶催化合成(R)?HPBE，進(jìn)而進(jìn)一步合成普利類藥物的酶?化學(xué)合成方法。還提供了編碼該酮還原酶的核酸序列，含有該核酸序列的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體及該酮還原酶的制備方法，以及該酮還原酶在催化羰基底物不對(duì)稱還原中的用途。相對(duì)于其它不對(duì)稱還原制備方法，使用本發(fā)明方法制備所得的產(chǎn)物濃度高，并且具有產(chǎn)物光學(xué)純度高、反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)便、易于工業(yè)放大的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酮還原酶，該酮還原酶的制備方法，以及該酮還原酶作為催化劑在不對(duì)稱合成手性羥基化合物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE,CAS號(hào)：90315-82-5)是一種手性仲醇，它是合成眾多血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑(即普利類藥物)的關(guān)鍵手性砌塊。

普利類藥物主要用于治療心力衰竭、高血壓。目前在中國(guó)抗高血壓藥物市場(chǎng)上主要有ACE抑制劑、鈣拮抗劑、血管緊張素II受體拮抗劑和β-受體阻滯劑四類抗高血壓藥物。普利類藥物近年受到沙坦類藥物的影響，銷量有所下降，但由于受到歐盟新標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)一些廠家退出的影響，價(jià)格較為穩(wěn)定。

自1977年Ondetti等研究開發(fā)了第一代的卡托普利后，普利類藥物已經(jīng)拓展到80多個(gè)衍生物，常見的幾種普利藥物如上所示。普利類藥物由于具有療效顯著、不良反應(yīng)小、作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上仍有廣泛的應(yīng)用前景。由于(R)-HPBE是該藥物的關(guān)鍵手性中間體，對(duì)于(R)-HPBE合成新方法的研究仍具有較大的實(shí)用意義和工業(yè)應(yīng)用前景。

合成(R)-HPBE的方法包括化學(xué)法和生物法。其中，化學(xué)法是由價(jià)廉易得的原料出發(fā)，經(jīng)過多步反應(yīng)最終合成(R)-HPBE。如由苯甲酸和丙酮酸經(jīng)過多步反應(yīng)生成2-羥基-4-苯基丁酸，再經(jīng)過去消旋化和酯化作用合成(R)-HPBE；再如由乙二酸二乙酯和苯丙酸乙酯作為起始原料，合成2-羰基-4-苯基丁酸乙酯后經(jīng)過不對(duì)稱氫化得到(R)-HPBE。化學(xué)法在產(chǎn)物規(guī)模上具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)，可達(dá)到500公斤的生產(chǎn)規(guī)模，但是，化學(xué)法要用到重金屬Pt等污染環(huán)境的催化劑，無法滿足綠色化學(xué)的要求且成本較高。另外，化學(xué)法存在收率較低、反應(yīng)條件較為苛刻、對(duì)底物的純度要求高、得到的產(chǎn)物的光學(xué)活性較低等缺點(diǎn)，所以不適合進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)的進(jìn)行。

目前生物法合成(R)-HPBE主要有兩種途徑，一種是利用脂肪酶來拆分rac-HPBE得到(R)-HPBE，或拆分rac-HPBA后經(jīng)過乙酯化得到(R)-HPBE。另一種途徑是用酮還原酶OPBE或OPBA進(jìn)行不對(duì)稱還原，生成(R)-HPBE或(R)-HPBA，(R)-HPBA可經(jīng)過進(jìn)一步酯化合成(R)-HPBE。利用酮還原酶進(jìn)行不對(duì)稱還原，理論得率可以達(dá)到100％，而脂肪酶的理論得率最高只能達(dá)到50％，酮還原酶具有一定的優(yōu)勢(shì)，但酮還原酶催化反應(yīng)通常需要額外添加價(jià)格昂貴的輔酶NAD⁺/NADP⁺。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)已報(bào)道的不對(duì)稱還原反應(yīng)制備(R)-HPBE反應(yīng)中收率較低、反應(yīng)條件較為苛刻、對(duì)底物的純度要求高、得到的產(chǎn)物的光學(xué)活性較低、或者需要添加價(jià)格昂貴的輔酶等問題，提供了一種催化活性高、對(duì)映選擇性強(qiáng)、底物耐受性好的酮還原酶，以及使用該酮還原酶催化合成(R)-HPBE，進(jìn)而進(jìn)一步合成普利類藥物的酶-化學(xué)合成方法。還提供了編碼該酮還原酶的核酸序列，含有該核酸序列的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體及該酮還原酶的制備方法，以及該酮還原酶在催化羰基底物不對(duì)稱還原中的用途。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案以解決上述技術(shù)問題：

本發(fā)明的第一方面提供了一種酮還原酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白質(zhì)：

(a)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。