[發明專利]一種酮還原酶及其在不對稱合成手性羥基化合物中的應用

有效

• 申請號: 201410541899.8
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN105567652B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 羅煜;丁時澄;瞿旭東;王海濤
• 申請（專利權）人: 上海弈柯萊生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 于永進

1.一種酮還原酶，其是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列組成的蛋白質。

2.編碼權利要求1所述的酮還原酶的分離的核酸。

3.根據權利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列組成的。

4.包含權利要求2或3所述的核酸的重組表達載體。

5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述的表達載體選自質粒、噬菌體或非噬菌體病毒載體。

6.根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述的質粒選自pET21a。

7.一種包含權利要求4～6任一項所述的重組表達載體的重組表達轉化體，其特征在于通過將權利要求4～6任一項所述的重組表達載體轉化至大腸桿菌宿主細胞中制得。

8.根據權利要求7所述的重組表達轉化體，其特征在于所述的大腸桿菌為E.coliBL21(DE3)。

9.一種重組酮還原酶的制備方法，包括培養權利要求7或8所述的重組表達轉化體，以及從所述培養物中獲得重組酮還原酶。

10.一種催化前手性羰基化合物進行不對稱還原反應形成手性羥基化合物的催化劑，其是權利要求7或8所述的重組轉化體的培養物，或通過將所述培養物離心分離后得到的轉化體細胞或者用所述轉化體細胞加工的制品。

11.權利要求10所述的所述的催化劑，其特征在于所述的轉化體細胞加工的制品為由轉化體細胞得到的提取物或通過對提取物中的酮還原酶進行分離和/或純化得到的分離產品，或者通過固定化轉化體細胞或提取物或轉化體的分離產品而得到的固定化制品。

12.一種權利要求1所述的酮還原酶、權利要求9所述的方法制備的重組酮還原酶或權利要求10所述的催化劑在催化前手性羰基化合物進行不對稱還原反應形成手性羥基化合物中的應用，其特征在于所述的前手性羰基化合物為式I所示的化合物：

其中，R選自H、甲基、乙基，R’選自H或Cl，n為0或2。

13.根據權利要求12所述的應用，其特征在于所述的前手性羰基化合物為2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2-(2-氯苯基)-2-氧代乙酸甲酯。

14.根據權利要求12-13任一項所述的應用，其特征在于所述應用包括下述步驟：在pH5.0～8.0的水溶液中，在葡萄糖和葡萄糖脫氫酶的存在下，在權利要求1所述的酮還原酶、權利要求9所述的方法制備的重組酮還原酶或權利要求10所述的催化劑的催化下，前手性羰基化合物進行不對稱還原反應，形成光學活性手性羥基化合物。

15.根據權利要求14所述的應用，其中所述的前手性羰基化合物在反應液中的濃度為10～1000g/L；所述的酮還原酶、重組酮還原酶或催化劑的用量為1～100U/L；所述的葡萄糖用量為50～100g/L，葡萄糖脫氫酶的用量為100～1000U/L。

16.根據權利要求14所述的應用，其特征在于所述的不對稱還原反應液中含有0～1mmol/L的NAD⁺。

17.根據權利要求14所述的應用，其特征在于；所述的不對稱還原反應在振蕩或攪拌條件下進行；所述的不對稱還原反應的溫度為20～45℃。

18.一種合成(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括使用權利要求1所述的酮還原酶、權利要求9所述的方法制備的重組酮還原酶或權利要求10所述的催化劑催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯進行不對稱還原反應。