[發明專利]一種建立含有Rickettisa菌和不含Rickettisa菌的煙粉虱種群的方法

有效

• 申請號: 201410539648.6
• 申請日: 2014-10-11
• 公開（公告）號: CN104285906A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 楊義婷;郭建洋;萬方浩;劉萬學;劉懷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明涉及昆蟲侵染型內共生菌種群的建立，具體為一種建立含有Rickettisa菌和不含Rickettisa菌的煙粉虱種群的方法。

背景技術

煙粉虱(Bemisiatabaci?Gennadaius)屬半翅目Hmioptera，粉虱科Aleyrodiae,小粉虱屬Bamisia，廣泛分布于全球除南極洲外各大洲的90多個國家和地區，其寄主范圍廣，可危害包括蔬菜、棉花及觀賞植物在內的600多種田間和溫室作物。煙粉虱主要存在以下三種危害，一是取食植物汁液，引起其生理異常，二是分泌蜜露誘發煤污病，三是傳播植物的雙生病毒，對我國的農業經濟造成了重大的影響。

內生菌在自然界中無處不在，幾乎所有的昆蟲都含有內共生菌。在長期進化的過程中，內共生菌與其昆蟲宿主已經形成互惠互利的關系。研究表明，昆蟲內共生菌可以協助宿主取食、消化與解毒，從而擴大宿主取食譜。昆蟲內生菌可以增強昆蟲自身防御病原微生物和寄生物的能力，也可以幫助宿主逃避天敵寄生或捕食，也可以調節宿主的耐熱性和增強宿主抗藥性，使得昆蟲宿主對環境適應能力增強。在煙粉虱中，Rickettisa菌可以提高其產卵量以及子代存活率；減少寄生蜂對其寄生。在蚜蟲中，Rickettisa菌可以改變其體表的顏色，增加其對瓢蟲的抗性。另外，它還可以提高昆蟲宿主的耐熱性，增加其適應性。目前，內共生菌在模式昆蟲的相關研究比較多，而關于煙粉虱此類具有較多復合種、遺傳進化復雜的昆蟲的研究還不成熟，僅僅只涉及與其生殖有關的研究。

研究表明，昆蟲內共生菌一般存在于一個特殊的組織—菌胞中，但腸腔和其他組織中也有存在。有些腸道菌只是暫時存在腸道中，有些卻是永久的存在腸道中。所以，研究者很難區分這些細菌到底是存在腸道里還是體腔內。煙粉虱體內的共生菌是屬于次生內共生菌，原位雜交實驗發現，這些內共生菌不僅存在菌胞中，也存在腸道和體腔中。這類共生細菌很難從煙粉虱體內分離出來。同時，由于這類內共生菌不能體外培養，對于這類共生菌功能的研究只能以煙粉虱為載體，這樣就加大對這類共生菌功能研究的難度。面對這一瓶頸問題，有些學者是用顯微注射的方法消除，但煙粉虱體型微小，導致死亡率高，同時對煙粉虱會造成一些物理性的傷害；但大部分研究者則是通過抗生素利福平消除處理，這樣會使煙粉虱體內的內共生菌Portiera和Hamiltonella消除，但其結果并不理想，而且不能建立相對穩定的無菌種群。而且，用抗生素福利平處理煙粉虱后，會導致煙粉虱發育遲緩，后代存活率降低。引起這些不利于煙粉虱的生長發育的原因究竟是煙粉虱內共生菌被消除的結果還是抗生素的副作用，目前不得而知。

鑒于以上方法都不能建立穩定的含菌和無菌種群，而且不能排除消除方法對煙粉虱內共生菌功能研究的影響，這樣會加大對煙粉虱內共生菌功能驗證的難度。針對這一瓶頸問題，本發明提供了一種建立穩定的無菌的煙粉虱種群的方法。

發明內容

為了解決現在昆蟲內共生菌研究中，內共生菌不能體外培養，用抗生素和注射法不能獲得穩定的相應種群的問題，本發明的目的是一種建立穩定的含有Rickettisa菌和不含有Rickettisa菌的煙粉虱種群的方法。

根據本發明建立煙粉虱的含有Rickettisa菌和不含Rickettisa菌的種群的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)從全國各地采集煙粉虱種群，在實驗室培養，其中光照條件為白天14h：黑夜10h，相對濕度為75％～85％；

(2)待種群量相對較大時，選取出若干煙粉虱于顯微鏡下觀察辨別雌雄；

(3)取已長出兩片真葉的甜瓜苗(Cucumismelo)，用微型養蟲籠夾在甜瓜苗的葉片上，用吸蟲管吸取雌雄煙粉虱各一頭，接于微型養蟲籠的下養蟲室，即甜瓜葉片的背面；

(4)3-4天過后，用自制吸蟲器將微型養蟲籠的煙粉虱取出，將甜瓜放在大型養蟲籠生長，其中光照條件為白天14h：黑夜10h，相對濕度為75％～85％；

(5)將微型養蟲籠的煙粉虱，單頭提取DNA，然后利用PCR方法對其DNA進行分子鑒定，所用引物如以下表1所示，利用煙粉虱內共生菌鑒定引物，鑒定種群內共生菌情況；

(6)待煙粉虱羽化后，取同一養蟲籠里的雌雄煙粉虱，重復(3)～(5)步驟，；

(7)純化至得到穩定的種群，經過連續單頭飼養并純化5代，即可以得到穩定的含菌種群和無菌種群。

根據本發明的方法，其中煙粉虱的DNA提取方法包括以下步驟：