[發明專利]植物油中動物源成分的LAMP法檢測引物和檢測方法

在審

• 申請號: 201410539293.0
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN104611412A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 謝鋰紗;譚志;俞凌云
• 申請（專利權）人: 四川出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 梁田

技術領域

本發明涉及分子生物學中用LAMP法對動物DNA的檢測，特別涉及對多種動物所共有DNA序列檢測的引物和用這種引物對多種動物共有DNA序列檢測的方法。

技術背景

檢測植物油中的動物源成分的意義在于我國是世界上食用植物油消費量最大國家，每年的消費總量大約是2500萬噸，廢棄油脂量逐年上升，有些不法商人在利益驅動下，將烹飪后的廢棄油（俗稱潲水油）經加工后作為食用植物油銷售。據專家用年消費總量減去每年國內食用植物油生產量和進口量推算，每年返回餐桌潲水油約有200-300萬噸之多，這還是比較保守的數字，因此不可低估潲水油重返餐桌的全國規模及其造成后果的嚴重性。對潲水油進行檢測鑒定是必須進行的一項公益性工作。目前，為進行此項工作，技術上的基本思路是：因純植物油理論上不含動物源性成分，而潲水油因已進行食品加工處理，理論上含有動物源成分，據此研究人員開發各種生物或理化檢測方法檢測植物油中的動物源性成分來判斷植物油中是否添加潲水油。

近年來，分子生物學先進檢驗技術開始應用于潲水油鑒別判斷。潲水油通常是多種動、植物油脂的混合物，含有大量的動物油脂。因此可通過檢測植物油中動物DNA來推斷該植物油是否摻入潲水油。由于潲水油在精煉過程中,?動物DNA會被嚴重降解,含量極低。研究表明，當肉加熱到100℃時DNA片段銳減到1100bp?左右，而加熱到120℃時減至600?bp?以下。所以該法的關鍵之一在于開發高靈敏度的檢測技術方法。目前，研究人員主要采用PCR和熒光定量PCR技術進行植物油中動物源成分檢測，PCR技術方法的主要問題是：需較昂貴的檢測設備，熒光定量PCR儀市場價格40-50萬元；使用專用檢測設備熒光定量PCR儀的操作較復雜；PCR技術檢測的靈敏度稍顯不足，我們的實驗在100ml植物油中加入炒制的1g動物肉，制成含動物源成分的植物油，使用熒光定量PCR方法無法檢出。

發明內容

本發明的目的是提供一種能比PCR技術檢測動物源性成分費用更低、靈敏度更高的LAMP檢測方法所用的引物，以及用這個引物在含動物源成份的植物油中高靈敏度的檢測出動物源的檢測方法。

本發明所說的5種畜禽是牛、豬、羊、雞和兔。

本發明所說的動物肉含義是牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和兔肉的某一種，或者其混含物。

本發明所說的動物源含義是牛肉DNA、豬肉DNA、羊肉DNA、雞肉DNA和兔肉DNA的某一種，或者其混含物。本發明所說的動物源也可稱為動物源DNA。

用本發明的引物的作用是，使用分子生物學LAMP檢測方法，在植物油中如能檢測出動物源DNA，可以作為該植物油可能是潲水油的一個依據。

用本發明設計的LAMP引物與引物是同一個概念。

用本發明所述的DNA核苷酸序列與所述的DNA序列是同一個概念。

本發明的引物設計思路是：選用5種畜禽DNA中都具有的、相同的DNA作為動物源DNA，該動物源DNA可代表所選用的5種畜禽DNA中的某一種，并還能代表這5種畜禽DNA的任意組合。該5種畜禽是牛、豬、羊、雞和兔。

本發明的LAMP技術也是LAMP法的含義，也就是環介導等溫擴增法（loop-mediatedisothermal?amplification，）簡稱LAMP技術或LAMP法。

本發明的引物設計技術概述：選用5種畜禽DNA中都具有的、并且對于這5種畜禽是高度保守的16S?rRNA?DNA序列中的片段作為靶基因序列，即在5種畜禽的16S?rRNA?DNA序列中選取了保守性最好、引物用于LAMP法檢測操作誤差小、引物對靶基因檢測靈敏度高的16S?rRNA?DNA序列中的片段作為引物技術設計的靶基因序列。達到所設計的引物能代表5種畜禽中任何一個畜禽16S?rRNA?DNA存在，而16S?rRNA?DNA又能代表有5種畜禽肉的目的。

本發明的引物設計原理如下：

（1）選取16S?rRNA?DNA作為靶基因序列：因食用肉種和動物油脂來源大部分為畜禽，檢測的DNA靶基因序列應在高等動物中具有各種易于檢測的特點。線粒體DNA?是高等動物唯一的核外遺傳物質，所有組織細胞中均含有大量的線粒體，因此可以獲得大量的線粒體DNA。本發明中，我們選擇了5種畜禽線粒體DNA中都具有的、并且在這5種畜禽DNA序列中高度保守的16S?rRNA?DNA序列作為靶基因序列。