[發明專利]植物油中動物源成分的LAMP法檢測引物和檢測方法

在審

• 申請號: 201410539293.0
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN104611412A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 謝鋰紗;譚志;俞凌云
• 申請（專利權）人: 四川出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 梁田

1.植物油中動物源成分的LAMP法檢測引物，該引物為4個單獨引物構成的引物組，該4個單獨引物為引物B3，引物F3，引物BIP，引物FIP；該4個單獨引物的核苷酸序列如下：

F3：???CCTATTCAAGAGTCCATATCGA

B3：???TTCTCTTGTCCTTTCGTACT

FIP：??GAACCTTTGATAGCGGTTGCAC-ATAGGGTTTACGACCTCGA

BIP：??GTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGA-CAGATAGAAACCGACC

TGG。

2.?用權利要求1所述植物油中動物源成分的LAMP法檢測引物對植物油中動物源成分的LAMP法檢測方法，其步驟如下：

步驟1、樣品制備5種畜禽混合肉末：市場上購買新鮮的牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和兔肉各100g，用天平稱取豬肉20g，雞肉20g，牛肉20g，羊肉20g和兔肉20g混合裝入燒杯1中；將燒杯1中的肉全部倒入絞肉機中絞碎混勻，直至所有的肉絞成肉末狀并混合均勻，將絞肉機中的所有肉末裝入燒杯2中，燒杯2中的混合肉末即為5種畜禽混合肉末；

步驟2、提取對照組植物油中的DNA：購買柱式植物油DNAout試劑盒(?北京天恩澤基因科技有限公司)；該柱式植物油DNAout試劑盒組成：溶液A，離心吸附柱，通用洗柱液（用于洗去非DNA物質），通用洗脫液（用于獲得DNA）；提取DNA的步驟如下：

A.在1.5mL離心管1中加入0.2mL購買的植物油；

B.在1.5mL離心管1中加入0.6mL溶化狀態的溶液A，植物油和溶液A在室溫條件下混合振蕩3-5min，獲得植物油和溶液A的混合液；

C.將B步驟的全部混合液轉移到離心吸附柱中，室溫放置2min，使離心吸附柱充分吸附混合液；

D.?把收集管套在離心吸附柱的下面；將已充分吸附混合液的離心吸附柱放入離心機，用離心機轉速為12000g?--15000g條件將其離心1min，離心機停止后，植物油和溶液A的混合液被分離出穿透液，穿透液在收集管中，取下收集管，去掉收集管中的穿透液；

E.?再把收集管套在離心吸附柱的下面；向離心吸附柱中加入0.8mL通用洗柱液，離心機轉速為12000g-15000g室溫離心1min，去掉收集管中的穿透液；

F.?再把收集管套在離心吸附柱的下面；離心機轉速為12000g-15000g室溫離心30秒，去掉收集管中的穿透液；

G.?在離心吸附柱的濾膜中部加入30uL通用洗脫液，然后將離心吸附柱套在一個1.5mL離心管2中，室溫放置2min，使通用洗脫液充分溶解吸附柱中的DNA；

H.?把裝有離心吸附柱的離心管2放入離心機，離心機轉速為12000g-15000g室溫離心1min，1.5mL離心管2中收集物為植物油的DNA樣品；

步驟3、制作含動物源成分的植物油樣品

用天平稱取1g上述步驟1中所制備的5種畜禽混合肉末樣品倒入家用平底鍋中，用量筒量取100mL步驟2的植物油倒入家用平底鍋中，把肉末樣品和植物油混合均勻；將平底鍋放在家用電磁爐上爆炒2min，爆炒溫度為1000℃；爆炒完后，將平底鍋中炒制過的肉末去除，炒過肉末的植物油是含動物源成分的植物油樣品；

步驟4、提取步驟3所得樣品的DNA，即提取含動物源成分植物油中的DNA

購買柱式植物油DNAout試劑盒(?北京天恩澤基因科技有限公司)?，柱式植物油DNAout試劑盒組成：溶液A，離心吸附柱，通用洗柱液（用于洗去非DNA物質），通用洗脫液（用于獲得DNA）；提取DNA的步驟如下：

A.在1.5mL離心管3中加入0.2mL步驟3含動物源成分的植物油樣品到廣口瓶1中；

B.在1.5mL離心管3中加入0.6mL溶化狀態的溶液A，將含動物源成分的植物油樣品和溶液A在室溫條件下混合振蕩3-5min，獲得含動物源成分的植物油和溶液A的混合液；

C.將B步驟的全部混合液轉移到離心吸附柱中，室溫放置2min，使離心吸附柱充分吸附混合液；

D.?把收集管套在離心吸附柱的下面；將已充分吸附混合液的離心吸附柱放入離心機，用離心機轉速為12000g?--15000g條件將其離心1min，離心機停止后，含動物源成分的植物油和溶液A的混合液被分離出穿透液，穿透液在收集管中，取下收集管，去掉收集管中的穿透液；

E.?再把收集管套在離心吸附柱的下面；向離心吸附柱中加入0.8mL通用洗柱液，離心機轉速為12000g-15000g室溫離心1min，去掉收集管中的穿透液；

F.?再把收集管套在離心吸附柱的下面；離心機轉速為12000g-15000g室溫離心30秒，去掉收集管中的穿透液；

G.?在離心吸附柱的濾膜中部加入30uL通用洗脫液，然后將離心吸附柱套在一個1.5mL離心管2中，室溫放置2min，使通用洗脫液充分溶解吸附柱中的DNA；

H.?把裝有離心吸附柱的離心管2放入離心機，離心機轉速為12000g-15000g室溫離心1min，1.5mL離心管2中收集物為含動物源成分植物油的DNA樣品；

步驟5、用LAMP法檢測DNA

購買脫氧核糖核酸擴增試劑盒（Loompamp朗報榮研化學株式會社），該脫氧核糖核酸擴增試劑盒組成為：

（1）??2?×?反應緩沖液（RM）

（2）??Bst?DNA?聚合酶（Bst?DNA?Polymerase）

（3）?去離子水（DW）??????????????????????????????????????????????????????

（4）?引物溶液?DNA（PM?DNA）

（5）?陽性對照?DNA（PC?DNA）；

LAMP法反應體系的試劑原料和配方如下：

2?×?反應緩沖液（RM）????????12.5μL

引物：??F3????????????????????0.5μL

????????B3????????????????????0.5μL

????????FIP????????????????????0.5μL

????????BIP???????????????????0.5μL

Bst?DNA?聚合酶????????????????1.0μL

去離子水（DW）???????????????6.5μL

模板DNA??????????????????????3.0μL

試劑合計25.0?μL?；

用LAMP法檢測DNA的步驟如下：

A.?處理含動物源成分植物油的DNA樣品：在生物安全柜中冰上操作，向?Loopamp?“朗報?”反應試管1中分別加入各原料：

加入12.5μL?的2?×?反應緩沖液（RM），

加入6.5μL去離子水（DW），

加入0.5μL?的F3，

加入0.5μL的?B3，

加入0.5μL?的FIP，

加入0.5μL?的BIP，

加入1.0μL的?Bst?DNA?聚合酶，

加入3.0μL?步驟4獲得的含動物源成分植物油的DNA樣品1.5mL于離心管4中；合上Loopamp?“朗報?”反應試管1蓋子，輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時注意不要產生氣泡；

B.?處理植物油的DNA樣品：在生物安全柜中冰上操作，向?Loopamp?“朗報?”反應試管2中分別加入各原料：

加入12.5μ的L?2?×?反應緩沖液（RM），

加入6.5μL的去離子水（DW），

加入0.5μL的?F3，

加入0.5μL?的B3，

加入0.5μL?的FIP，

加入0.5μL的?BIP，

加入1.0μL?的Bst?DNA?聚合酶，

加入3.0μL的植物油的DNA樣品在1.5mL離心管2中，該樣品作為陰性對照；Loopamp?“朗報?”反應試管2蓋子，輕擊使溶液充分混合后瞬時離心；混合時請注意不要產生氣泡；

C.?將兩個試樣分別加熱反應：將Loopamp?“朗報?”反應試管1和Loopamp?“朗報?”反應試管2分別放入63℃恒溫水浴鍋中水浴60min，然后將Loopamp?“朗報?”反應試管1和Loopamp?“朗報?”反應試管2放入95℃恒溫水浴鍋中水浴2min，使反應體系中的Bst?DNA?聚合酶滅活以終止反應；

D.?觀察兩個試樣的反應結果：用肉眼觀察Loopamp?“朗報?”反應試管1和Loopamp?“朗報?”反應試管2中是否有白色渾濁；結果為：Loopamp?“朗報?”反應試管1中有白色渾濁，Loopamp?“朗報?”反應試管2中無白色渾濁；反應試管1中是含動物源成分植物油的DNA樣品，LAMP法檢測有白色渾濁；反應試管2中是植物油的DNA樣品，LAMP法檢測無白色渾濁；

所述植物油是純玉米油、純花生油或純菜籽油的某一種。