[發明專利]膠原纖維固定化大腸桿菌作為生物傳感器識別元件快速測定BOD的方法

無效

• 申請號: 201410537863.2
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN104267082A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

?本發明屬于生物傳感器領域，提供了用于生化需氧量生物傳感器的膠原纖維固定化大腸桿菌生物識別元件的制備及其使用方法。

背景技術

?生化需氧量（Biochemical?Oxygen?Demand，BOD）是一項衡量水質污染程度的重要指標，表示水中有機物經微生物生化作用分解時所消耗的溶解氧量。國內外測定BOD值的傳統方法是5日生化需氧量接種稀釋法(BOD₅法)，即樣品在20±1℃條件下培養5d，測定樣品培養前后的溶解氧，兩者之差即為5日生化需氧量，但此法耗時耗力、重現性差且不宜現場監測。近年來，微生物傳感器法由于其測定時間短、操作簡便、易于現場監測等優點而被逐漸應用于BOD的檢測。

?BOD微生物傳感器主要由固定化微生物、信號轉換裝置和信號輸出裝置組成，其中固定化微生物對傳感器的靈敏度、響應范圍等性能均有重要影響。常見的微生物固定化載體有聚乙烯醇、活性交聯樹脂、溶膠凝膠等，但這些載體大多傳質性能及生物相容性較差，使得由其制得的傳感器普遍存在響應值較小、測量范圍較窄、微生物利用率較低等問題。

膠原纖維是一種天然高分子材料，金屬離子鋯（Zr）、鐵（Fe）等改性后的膠原纖維具有良好的傳質性能、生物相容性、熱穩定性、耐生物降解性及廣泛的酸堿適應范圍等優點。將其作為微生物固定化載體制備微生物傳感器，可較大程度增加固定微生物用量并保持較高微生物利用率。

大腸桿菌是一種易于培養、呼吸活性強、適應范圍廣的細菌，金屬離子鋯（Zr）改性后的膠原纖維對大腸桿菌具有較大的固定量且能使其保持較穩定的活性。本專利以金屬離子鋯（Zr）改性膠原纖維（ZICF）為載體固定大腸桿菌作為生物識別元件制備BOD微生物傳感器，基于ZICF良好的傳質性能及生物相容性，本發明對傳感器靈敏度、測量范圍等性能的提升有較大意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種以膠原纖維固定化大腸桿菌作為生物識別元件快速測定BOD的方法，其特征在于，該方法包括選擇膠原纖維固定化大腸桿菌作為生物識別元件，制備膠原纖維固定化大腸桿菌生物識別元件的方法，利用膠原纖維固定化大腸桿菌作為生物識別元件對BOD的快速測定方法，以及該固定化大腸桿菌的保存方法和該微生物敏感膜的活化方法。

??所述膠原纖維固定化大腸桿菌作為生物識別元件的原因如下：

??1)?膠原纖維作為一種天然高分子材料，具有通透性好、耐曝氣強度高、生物相容性好、成本低廉、機械性能好、酸堿適應范圍廣等優點；

2)?經金屬離子改性后的膠原纖維在保持膠原纖維原有優良性能的基礎上，更具備了良好的耐熱性和耐生物降解性；

3)?ZICF良好的傳質性能使得傳感器中固定微生物用量可適當增大，從而拓寬傳感器的線性響應范圍，提升傳感器的靈敏度；?

4)??膠原纖維固定大腸桿菌具有固定量大、微生物活性高的特點，這些特點可使傳感器獲得更寬的線性響應范圍；

??5)?膠原纖維固定化大腸桿菌作為生物識別元件具有使用壽命長，識別元件保存和活化方法簡單的特點。

?所述金屬離子鋯（Zr）改性膠原纖維固定化載體（ZICF）由已有方法制備（發明專利：膠原纖維固載金屬離子吸附材料及其制備方法和用途，專利號：?200410040145.0）。

所述固定化大腸桿菌的制備方法：稱取干重0.5g?ZICF置于無菌水中浸泡5-12h。大腸桿菌在營養肉湯培養基中活化培養18-24h，經離心、無菌生理鹽水清洗后收集細胞，將其加入無菌生理鹽水中制得菌懸液，并調節菌懸液濃度為10^-7-10^10?cfu/mL。將ZICF過濾后加入上述菌懸液中，37℃震蕩吸附5h后用無菌生理鹽水清洗至無游離菌檢出，即得膠原纖維固定化大腸桿菌。

所述生物識別元件的制備方法：每次稱量濕重為0.10-0.30g的膠原纖維固定化大腸桿菌，將固定化大腸桿菌置于兩層200目尼龍網之間，使之形成一層固定化微生物膜，使用時將該膜緊貼于溶解氧電極頭前的半透膜上，并用電極帽固定。