[發(fā)明專利]含抗稻瘟病基因重組DNA片段植株的選育方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410532684.X | 申請日： | 2014-10-10 |
| 公開（公告）號： | CN105567791B | 公開（公告）日： | 2018-12-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 周發(fā)松;劉剛;韋懿;宋丁丁;喻輝輝;姚玥;李旭;潘麗;李菁;陳光;陸青;張學(xué)堂;邱樹青;何予卿;李榮田;張啟發(fā) | 申請（專利權(quán)）人： | 中國種子集團(tuán)有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;A01H1/02 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 100045 北京市西*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 稻瘟病 基因 重組 dna 片段 植株 選育 方法 | ||
本發(fā)明提供一種含抗稻瘟病基因重組DNA片段植株的選育方法，即利用正向及負(fù)向選擇標(biāo)記、水稻全基因組育種芯片技術(shù)通過五世代獲得背景與受體親本‘空育131’完全一致，且僅含供體親本‘K22’抗稻瘟病基因DNA片段的穩(wěn)定的目標(biāo)植株。另外本發(fā)明還提供利用該方法獲得的一個抗稻瘟病基因重組DNA片段及其檢測方法。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及遺傳學(xué)、基因組學(xué)和分子育種領(lǐng)域，具體地說，涉及全基因組選擇育種技術(shù)以及利用該技術(shù)快速精確選育含抗稻瘟病基因重組DNA片段植株的方法。
背景技術(shù)
稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對稻瘟病研究的逐步深入，許多水稻抗稻瘟病基因DNA片段相繼被定位和克隆。其中，水稻第6染色體的Pi2區(qū)間被定位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50，該區(qū)間包含一個稻瘟病抗性基因的基因簇(Dai等，2010；Qu等，2006；Wang等，2012；Zhou等，2006；Xiao等，2012；Liu等，2002；Liu等，2011；Jiang等，2012；Zhu等，2012；Deng等，2006)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供含抗稻瘟病基因重組DNA片段的水稻植株的選育方法，包括以下步驟：
(1)以水稻‘空育131’為輪回親本，含抗稻瘟病基因DNA片段的‘K22’為供體親本進(jìn)行雜交和回交，獲得BC1F1代；利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4和負(fù)向選擇標(biāo)記RM19814、RM19835對BC1F1代進(jìn)行抗稻瘟病基因DNA片段單側(cè)同源重組片段篩選，并用水稻全基因組育種芯片RICE6K對其進(jìn)行背景選擇；
(2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株與受體親本‘空育131’進(jìn)行回交，獲得BC2F1代，利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4對其進(jìn)行檢測，選擇含有抗稻瘟病基因DNA片段的重組單株，然后用水稻全基因組育種芯片RICE6K對其進(jìn)行背景選擇；
(3)選擇背景回復(fù)好的重組單株再次與受體親本‘空育131’進(jìn)行回交，獲得BC3F1代，利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4和負(fù)向標(biāo)記RM19814、RM19835對BC3F1代進(jìn)行抗稻瘟病基因DNA片段另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進(jìn)行背景選擇，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段小，且背景回復(fù)好的重組單株；
(4)選中的重組單株自交一次，獲得BC3F2代；利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4對BC3F2代進(jìn)行檢測，并利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進(jìn)行背景選擇，最終獲得目標(biāo)基因組DNA片段純合，且背景完全回復(fù)的含抗稻瘟病基因重組DNA片段的水稻植株；
其中，所述抗稻瘟病基因重組DNA片段兩側(cè)的同源重組片段的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
本發(fā)明還提供利用上述方法獲得的一個抗稻瘟病基因重組DNA片段，該片段兩側(cè)的同源重組片段的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
本發(fā)明還提供用于檢測上述抗稻瘟病基因重組DNA片段的方法。根據(jù)該片段兩側(cè)的同源重組片段的核苷酸序列，分別設(shè)計特異性PCR擴(kuò)增引物，以待測水稻基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
優(yōu)選地，采用Sanger測序法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
用于擴(kuò)增及檢測SEQ ID No.1所示同源重組片段的引物組合為：
組合I
擴(kuò)增引物：
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