[發(fā)明專利]一種埃博拉病毒快速分型鑒別檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410530911.5
• 申請(qǐng)日: 2014-10-10
• 公開（公告）號(hào): CN104328216A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周其偉;楊海星;李麗梅;周阿濤;高秀潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種埃博拉病毒型別鑒定檢測(cè)的試劑盒，特別是涉及一種利用多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)一管反應(yīng)即可鑒別出埃博拉病毒四種致病性型別的試劑盒。本試劑盒主要包括RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC?H₂O，以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒能準(zhǔn)確區(qū)分4種致病性型別的埃博拉病毒即：扎伊爾型埃博拉病毒、本迪布焦型埃博拉病毒、蘇丹型埃博拉病毒、塔伊森林型埃博拉病毒，可廣泛應(yīng)用于埃博拉病毒病臨床早期診斷、重癥病例預(yù)警、口岸檢驗(yàn)檢疫、疫情防控、媒介控制及科學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

埃博拉病毒病(EVD；以往稱為埃博拉病毒性出血熱)是嚴(yán)重的、往往致命的人類疾病。在1976年首次發(fā)生于剛果民主共和國(前扎伊爾)埃博拉河流域，因其引起病人全身性出血癥狀，故命名為埃博拉出血熱。世界衛(wèi)生組織(WHO)已經(jīng)將其列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的傳染病之一，并規(guī)定有關(guān)其活病毒的研究必須在生物安全4級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。EVD的病原體是埃博拉病毒，主要通過體液、血液、分泌物進(jìn)行傳播。埃博拉病毒通過干擾感染者機(jī)體凝血平衡，導(dǎo)致血管壁破壞或功能受損，血小板不能凝血，在2-21天內(nèi)出現(xiàn)出血性休克或器官衰竭，死亡率很高。

埃博拉病毒隸屬于絲狀病毒科(Filoviridae)，絲狀病毒屬(Filovirus)，是非分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。埃博拉病毒屬包括五種不同的型別：本迪布焦埃博拉病毒(BDBV)、扎伊爾埃博拉病毒(EBOV)、雷斯頓埃博拉病毒(RESTV)、蘇丹埃博拉病毒(SUDV)和塔伊森林埃博拉病毒(TAFV)。除雷斯頓埃博拉病毒對(duì)人呈隱形感染外，其余4亞型對(duì)人都有致死性。本迪布焦埃博拉病毒、扎伊爾埃博拉病毒和蘇丹埃博拉病毒與非洲埃博拉病毒病大型疫情相關(guān)，而雷斯頓埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒則與之無關(guān)。

埃博拉病毒病病人樣本具有極端生物危害風(fēng)險(xiǎn)；只有在最高級(jí)別的生物防護(hù)條件下才可進(jìn)行檢測(cè)。埃博拉病毒感染可通過若干類型的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)獲得明確診斷，如：抗體捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、抗原檢測(cè)試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、常規(guī)RT-PCR檢測(cè)、Real?time?RT-PCR檢測(cè)、電子顯微鏡檢查和病毒分離培養(yǎng)。但是，血清學(xué)試驗(yàn)、病毒培養(yǎng)具有靈敏度低、免疫交叉反應(yīng)以及周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)；而常規(guī)RT-PCR又容易產(chǎn)生污染，造成假陽性的產(chǎn)生。多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是將PCR技術(shù)和多色熒光標(biāo)記探針相結(jié)合的先進(jìn)技術(shù)，該方法具有快速、特異、靈敏、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，結(jié)合防污染技術(shù)處理，特別適合于大規(guī)模、快速診斷的需求。該技術(shù)采用多色熒光對(duì)多條種特異性探針進(jìn)行標(biāo)記，配合多重PCR技術(shù)，可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中對(duì)多個(gè)病毒同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，各色熒光的增長(zhǎng)信號(hào)與相應(yīng)PCR產(chǎn)物的增長(zhǎng)量成等比關(guān)系，并被自動(dòng)化熒光檢測(cè)儀收集，最后可通過分析熒光增長(zhǎng)曲線達(dá)到檢測(cè)病原體類型的目的。由于，熒光PCR技術(shù)具有擴(kuò)增片段短，引物、探針具有雙重特異等優(yōu)點(diǎn)，因此，將多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于埃博拉病毒分型的快速檢測(cè)，能夠節(jié)約時(shí)間、減少取材數(shù)量、提高檢測(cè)鑒別效率，能在短時(shí)間內(nèi)判斷疑似病例或可疑媒介是否感染致病性埃博拉病毒及同時(shí)確診所感染的型別，便于臨床及時(shí)采取必要的防控和治療措施，防止這些病毒繼續(xù)傳播，并提高診療效率，為快速診斷、有效監(jiān)測(cè)和針對(duì)性治療提供支持和依據(jù)。

本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對(duì)埃博拉病毒的四種致病性型別(本迪布焦型、扎伊爾型、蘇丹型和塔伊森林型)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)記的四色熒光的擴(kuò)增情況，來鑒別埃博拉病毒的致病性型別。本發(fā)明的試劑盒可廣泛地運(yùn)用于由埃博拉病毒引發(fā)的埃博拉出血熱或疑似埃博拉出血熱患者的樣本檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室診斷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行對(duì)四種致病性埃博拉病毒型別的鑒別試劑盒，利用本試劑盒可以準(zhǔn)確區(qū)分本迪布焦埃博拉病毒、扎伊爾埃博拉病毒、蘇丹埃博拉病毒和塔伊森林埃博拉病毒。

在對(duì)GENBANK上所有已知的埃博拉病毒各致病性型別的核酸序列進(jìn)行比對(duì)的基礎(chǔ)上，分別尋找各型別核酸序列的特異性保守區(qū)，并針對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)靶核苷酸引物和探針。這些引物探針在含有耐熱DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶、高質(zhì)量脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反應(yīng)酶系以及含有Mg²⁺等成份的RT-PCR反應(yīng)液中，通過熒光PCR儀實(shí)現(xiàn)體外核酸的循環(huán)擴(kuò)增。