[發明專利]益生菌中黑芥子酶活性檢測方法

有效

• 申請號: 201410530104.3
• 申請日: 2014-10-10
• 公開（公告）號: CN104342482A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 單毓娟;張蘭威;李寶龍;任明華;宋微;雷鵬;何燦霞;田思聰
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 哈爾濱龍科專利代理有限公司 23206
• 代理人: 高媛

技術領域

本發明涉及一種檢測益生菌黑芥子酶活性的方法。

背景技術

黑芥子酶學名為β-硫代葡萄糖苷酶，又被稱為β-硫代葡萄糖苷水解酶，主要在十字花科植物中被發現，是迄今為止大自然中唯一發現的β-硫葡萄糖苷水解酶。黑芥子酶有多種同工酶，分別存在于不同十字花科植物組織中。從油菜和白芥中提純的黑芥子酶是一個二聚體蛋白質，其分子質量約為135kD-150kD。黑芥子酶很少以游離狀態存在，而是與諸如黑芥子酶結合蛋白或黑芥子酶協助蛋白一類的輔酶形成蛋白質復合體。一般情況下，十字花科植物中的黑芥子酶會與硫甙葡萄糖苷形成相對獨立的硫甙葡萄糖苷-黑芥子酶體系，只有在植物組織受到破壞時兩者才能相互接觸發生反應生成有毒的硫氰酸鹽、異硫氰酸鹽和腈，其中異硫氰酸鹽對昆蟲有較高的毒性，可對植物起到一定的保護作用。黑芥子酶活性易受外界環境的影響，像溫度和pH都能較大的影響反應時的酶活性。此外，抗壞血酸、Fe²⁺和Cu²⁺也產生一定影響。其中，抗壞血酸表現為低濃度激活酶活性，高濃度抑制酶活性。一般認為Fe²⁺為酶激活劑，Cu²⁺為酶抑制劑。?

黑芥子酶的活性一般通過測定產物葡萄糖的生成量或者底物硫甙葡萄糖苷濃度的變化來確定。對于葡萄糖的生成量，可以使用葡萄糖試劑盒來測定，這也是黑芥子酶活性測定時的經常使用的方法。分光光度法也是可行的，如Sandro?Palmieri介紹的以黑芥子硫苷酸鉀為酶解底物進行一系列反應，通過在340nm處檢測NADPH生成時吸光度值的變化來測定十字花科蔬菜中黑芥子酶活性。另外氣相色譜內標法、pH值法和電極法都能測定蔬菜中黑芥子酶活力。但這些方法易受樣品中含有雜質葡萄糖以及黑芥子酶提取不純的干擾，抑或存在實驗要求條件較高、實驗操作性不強等問題。硫甙葡萄糖苷濃度的變化也可以采用分光光度法測定，張蕾等以黑芥子硫苷酸鉀為底物進行酶解，通過檢測因黑芥子硫苷酸鉀濃度降低而引起的吸光度減少的大小來測定擬南芥中黑芥子酶活性。該方法取樣量小，適合于批量測定,但也存在酶活力較低時難以檢測或結果不明顯等問題。此外，高效液相色譜（HPLC）法和高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-?MS）法也是常用的測定十字花科蔬菜中黑芥子酶活性的方法。

國外的最新研究表明，硫甙葡萄糖苷能被腸道中的微生物水解。如在小鼠試驗中觀察到蘿卜苷被分解成異硫氰酸鹽。研究者使蘿卜苷和萊菔硫烷無損失的進入小鼠盲腸，使其被水解，在腸粘膜血清中檢測出了異硫氰酸鹽。Lila?Elfoul等將人體腸道內的多形擬桿菌移植到小鼠腸道，發現其能夠分解黑芥子硫苷酸鉀形成異硫氰酸鹽。而在體外實驗中，小鼠腸道菌群也能分解蘿卜苷產生低濃度的異硫氰酸鹽。D.-L.?Cheng等在體外實驗中發現，三種雙歧桿菌：假鏈雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和長雙歧桿菌在pH=7時水解硫甙葡萄糖苷生成異硫氰酸鹽，而在pH降到5.2時只生成了腈。上述研究表明，多形擬桿菌及雙歧桿菌等桿菌類益生菌多具有黑芥子酶活性。但以上研究僅僅是通過測定分解產物異硫氰酸鹽的生成來證明腸道微生物具有黑芥子酶活性，并未進一步對黑芥子酶進行提純分析或對其酶活力進行測定，且以上研究多采用質譜法或色譜法，對實驗設備和實驗成本要求較高。

發明內容

本發明的目的是提供一種益生菌中黑芥子酶活性檢測方法，該方法采用酶解和超聲菌體破碎相結合的方法對菌液中的酶活性進行靈敏檢測。

本發明的目的是通過如下技術方案實現的：

一、將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養基中，于37℃恒溫培養24h，如此反復活化2-3次即可使菌株恢復活力。

本步驟中，所述益生菌為桿菌類益生菌（乳桿菌和雙歧桿菌）。

本步驟中，所述改良MRS液體培養基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物?10g、酵母提取物?5.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸鈉2.0g、磷酸氫二鉀?2.0g、七水硫酸鎂?0.2g、七水硫酸錳?0.05g，溶于水，然后加1ml?吐溫?80，用水調至1000ml。

二、初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液5mL培養待篩菌株，培養時間48h，培養溫度30℃，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用于下一步實驗。

本步驟中，所述含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液的配制方法如下：無菌100mmol/L黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養基以1:20?的體積比混合。