[發明專利]一種苜蓿中華根瘤菌株及其組合物與應用

有效

• 申請號: 201410529336.7
• 申請日: 2014-10-10
• 公開（公告）號: CN104342390A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 張大偉;李莎;夏苗苗;房歡;周文娟;鄭平
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/42;C12R1/01
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于生物資源、微生物發酵和大分子天然產物生物合成技術領域。涉及一株生產維生素B₁₂的菌株，苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium?medicae），以及利用該菌株發酵制備維生素B₁₂的方法，更具體的說是一種苜蓿中華根瘤菌株及其組合物與應用。?

背景技術

維生素B₁₂又叫鈷胺素（Cobalamin），屬于咕啉類化合物，是目前唯一一個含有金屬離子的維生素類化合物，從維生素B₁₂的結構可以看出，其基本結構包括咕啉環和配基。中心咕啉環由相連的4個吡咯和1個鈷原子組成，鈷螯合在4個吡咯中心。咕啉環上方的配基種類不同，構成不同類型的鈷胺素，一般可以構成四個類型：（1）當配基為氰基時形成氰基鈷胺素（Cyanocobalamin）；（2）當配基為羥基時形成羥基鈷胺素（Hydroxocobalamin）；（3）當配基為脫氧腺苷時形成脫氧腺苷鈷胺素（Adenosylcobalamin）；（4）當配基為甲基時形成甲基鈷胺素（Methylcobalamin）。?

一般藥品中鈷胺素的存在形式為氰基鈷胺素，但是，在體內能夠發揮作用的鈷胺素為腺苷鈷胺素，氰基鈷胺素需要轉化為腺苷鈷胺素之后才能發揮治療作用。因此，對于一些較嚴重的患者，需要直接注射避光保存的腺苷鈷胺素達到快速治療的效果。

維生素B₁₂合成方法包括人工合成法和微生物發酵法，人工合成過程中存在著不可逾越的問題，因此，科學家們又開始探索維生素B₁₂在微生物體內的合成過程，來解決維生素B₁₂的生產問題。生產菌株主要有厭氧發酵菌株費氏丙酸桿菌、謝氏丙酸桿菌等，好氧發酵菌株脫氮假單胞菌、沼澤紅假單胞菌、粗糙諾卡氏菌等。微生物合成維生素B₁₂有兩條途徑：一種是好氧途徑；另一種是厭氧途徑。好氧途徑首先合成咕啉環，然后將鈷原子螯合到環內；而厭氧途徑是將鈷原子螯合到卟啉環中后，再結合其他原子形成含有鈷原子的咕啉環。其它合成過程中，厭氧途徑和好氧途徑相同，只是每種途徑催化的酶不同。

微生物法、比色測定法、間接測定法、高效毛細管電泳法、薄層層析法和高效液相色譜法檢測發酵液中B₁₂的含量。但微生物法檢測耗時長，靈敏度低，不利于發酵過程中檢測；比色法僅適于分析藥品等成分比較簡單的樣品，但對于發酵或者成分復雜的樣品存在干擾作用；間接法通過鈷含量的變化推算維生素B₁₂的含量，雖然檢測方法準確快速，但是樣品本身含有鈷，因而會造成很大誤差；高效毛細管電泳法由于檢測限低，會導致食品等含有微量維生素B₁₂的檢測有局限性；薄層層析法由于上樣量不能統一，所以在定量檢測中具有局限性；高效液相色譜法可以檢測含量較低，成分復雜的樣品中維生素B₁₂的含量，具有簡便、快速、準確的優點。

發明內容

本發明的目的在于克服現有資源的不足，一方面提供一株土壤中分離得到苜蓿中華根瘤菌TIB.SM.2013保藏號CGMCC?No.?9638。?

本發明的另一個方面是提供一種維生素B₁₂的生物合成制備方法，通過利用苜蓿中華根瘤菌TIB.SM.2013保藏號CGMCC?No.?9638，液體長時間發酵而制備維生素B_12。

為實現上述目的本發明公開了如下的技術內容：

一種苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）TIB.SM.2013，從土壤中分離得到，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC?No.?9638，其詳細的技術內容如下：

（1）本申請人于2013年6月在天津市三葉草種植土樣中分離、篩選到一株高效的菌株TIB.SM.2013。經過形態觀察，生理生化試驗和16SrDNA鑒定，屬于苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）。申請人于2014年9月4日將該菌株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC?No.?9638。保藏日期：2014年9月4日；單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院。

（2）苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）TIB.SM.2013的細菌學特征及生理生化指標：