[發(fā)明專利]一種苜蓿中華根瘤菌株及其組合物與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410529336.7
• 申請(qǐng)日: 2014-10-10
• 公開（公告）號(hào): CN104342390A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張大偉;李莎;夏苗苗;房歡;周文娟;鄭平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P19/42;C12R1/01
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）TIB.SM.2013，從土壤中分離得到，由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC?No.?9638。

2.權(quán)利要求1所述苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）TIB.SM.2013，保藏號(hào)CGMCC?No.?9638在制備生物合成維生素B₁₂方面的應(yīng)用。

3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其在發(fā)酵液中產(chǎn)生維生素B₁₂的濃度至少為50?mg/L。

4.一種組合物，它包括苜蓿中華根瘤菌發(fā)酵液、苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）TIB.SM.2013，保藏號(hào)CGMCC?No.?9638。

5.一種采用權(quán)利要求1所述苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）TIB.SM.2013，保藏號(hào)CGMCC?No.?9638生產(chǎn)維生素B₁₂的培養(yǎng)和提取方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

（1）將苜蓿中華根瘤菌株斜面菌種接種到裝有培養(yǎng)基的三角瓶中，在28-32?℃，150-220?rpm搖床振蕩條件下，培養(yǎng)36?h，制備種子液；

（2）將種子液按5-20%的接種量（V/V）接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，然后在25-30?℃培養(yǎng)6-9天，得到苜蓿中華根瘤菌發(fā)酵液；

（3）在步驟（2）獲得的發(fā)酵液中添加8%亞硝酸鈉溶液和冰醋酸1:1（V/V），沸水浴20-30?min釋放菌體中的產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化為氰基鈷胺素，10000-12000?rpm離心10?min收集上清液分離檢測(cè)產(chǎn)物；

所述培養(yǎng)基按重量由以下組分組成：

6-40份碳源、????5-30份有機(jī)氮源、

0.5-10份無機(jī)鹽，加水至1000份，調(diào)節(jié)pH=6.8-7.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述采用苜蓿中華根瘤菌株生產(chǎn)維生素B₁₂的培養(yǎng)和提取方法,其特征是所述培養(yǎng)和提取方法用于所有維生素B₁₂生產(chǎn)菌株，包括桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、沙門氏菌屬、鏈霉菌屬、沙雷氏菌屬、鏈球菌、X黃單胞菌屬；優(yōu)選的菌株為根瘤菌屬，進(jìn)一步優(yōu)選為苜蓿中華根瘤菌。

7.權(quán)利要求5所述采用苜蓿中華根瘤菌株生產(chǎn)維生素B₁₂的培養(yǎng)和提取方法，其特征是所述碳源為蔗糖、麥芽糖、乳糖或甜菜堿。

8.權(quán)利要求5所述采用苜蓿中華根瘤菌株生產(chǎn)維生素B₁₂的培養(yǎng)和提取方法，其特征是所述有機(jī)氮源為玉米漿、酵母抽提物、酵母浸粉、酵母浸膏、酵母粉、酵母自溶粉或玉米漿粉。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述采用苜蓿中華根瘤菌株生產(chǎn)維生素B₁₂的培養(yǎng)和提取方法，其特征是所述無機(jī)鹽是由下述原料組成：

七水硫酸鎂0.1-2?g/L、?磷酸氫二鉀0.5-3?g/L、?硫酸鋅0.2-1?g/L、?硫酸錳0.1-3?g/L、氯化鈷0.3-5?g/L、?5、6—二甲基苯并咪唑0.01-2?g/L。

10.權(quán)利要求1所述苜蓿中華根瘤菌株（Sinorhizobium?medicae）TIB.SM.2013，保藏號(hào)CGMCC?No.?9638在制備生物合成維生素B₁₂方面的應(yīng)用。