[發(fā)明專利]利用紙質微流體進行核酸等溫擴增的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410528335.0
• 申請日: 2014-10-09
• 公開（公告）號: CN104293945A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設計）人: 王歡;府偉靈;黃慶;王云霞;張立群;黃君富
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 譚春艷

技術領域

本發(fā)明涉及微流體技術領域，特別是涉及一種利用紙質微流體進行核酸等溫擴增的方法及實施這種方法的裝置。

背景技術

以PCR為代表的核酸擴增技術一直在科研和臨床工作中被普遍地使用?；诜肿由飳W的快速發(fā)展，先后開發(fā)出了許多新的核酸等溫擴增方法，例如：核酸序列依賴性擴增法(NASBA)、自序列復制(3SR)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)、鏈置換擴增法(SDA)等。但是傳統(tǒng)的PCR擴增需要昂貴的專門的擴增儀器，操作人員也需要專業(yè)的培訓，檢測成本高，由于擴增儀器體積較大、重量較重，使得檢測地點不能靈活移動。

一直以來，在一個平臺上能簡單、快速、準確、有效的進行多通道檢測是醫(yī)學、生化、環(huán)境等各界學者們的共同期盼。微流體芯片技術(microfluidics?technology)具有方便、易于攜帶、高效、低耗(包括時間、標本、試劑)、分析微型化和實驗通量化的特點，并且通過結合傳感或樣品前處理模塊，增加了分析檢測的有效性，減少了交叉污染，為現(xiàn)場檢測或及時檢測(point-of-care,POC)提供了一種快速診斷的方法。恒溫微流體核酸擴增芯片技術是一種創(chuàng)新性結合核酸等溫擴增和微流控芯片的一種用于核酸快速擴增和結果肉眼判定的新型技術。但是微流體器件一般采用半導體或集成電路加工模式實現(xiàn)，過程繁瑣，工藝復雜，迄今成本仍遠不能達到用完即棄的目標。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用紙質微流體進行核酸等溫擴增的方法，該方法操作方便、不需要專門的核酸擴增儀器，擴增成本低，可同時進行多項檢測。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種利用紙質微流體進行核酸等溫擴增的方法，包括以下步驟：

(1)制備待測樣品DNA溶液；

(2)根據(jù)檢測項目，將相應的引物包被在紙質微流體的反應區(qū)上，所述紙質微流體包括由濾紙制成的反應層和至少一層加樣層，所述加樣層重疊放置在反應層的上方，所述加樣層中心設有加樣孔，所述加樣層上圍繞加樣孔均布有多個反應孔，所述加樣孔和反應孔的孔口上均涂覆有疏水材料；所述反應層上設有由疏水材料畫出的與加樣孔相對應的樣品區(qū)、與反應孔對應的多個反應區(qū)以及反應通道，所述反應區(qū)直徑與反應孔的直徑相同，所述樣品區(qū)的直徑小于加樣孔的直徑，每個反應區(qū)通過一個反應通道與樣品區(qū)連通，所述反應通道的寬度從反應區(qū)到樣品區(qū)逐漸變小；

(3)將步驟1制備的待測樣品DNA溶液根據(jù)檢測項目混合成擴增反應體系，滴加在紙質微流體的加樣孔中，加熱紙質微流體使其溫度達到核酸擴增所需要的溫度并保持恒溫；

(4)擴增反應完成后，觀察紙質微流體反應區(qū)的顏色變化，即可得到檢測結果。

采用上述技術方案，

紙質微流體的加樣孔和反應孔的孔口上均涂覆有疏水材料，反應層上設有由疏水材料畫出的與加樣孔相對應的樣品區(qū)、與反應孔對應的多個反應區(qū)以及反應通道，使得待測樣品溶液通過加樣孔滴加到樣品區(qū)后不能通過疏水材料擴散到濾紙層的其它地方，從而將不同項目的檢測隔開，一個微流體能同時進行多項不同的檢測。

作為優(yōu)選地，所述步驟2中在紙質微流體的反應區(qū)上包被引物是通過生物素化引物和親和素化微凝膠偶聯(lián)結合，室溫干燥沉淀在反應區(qū)上?？梢愿鶕?jù)檢測對象的不同，事先在微流體反應區(qū)上包被對應的引物，實現(xiàn)檢測目的。

作為優(yōu)選地，所述步驟2中的紙質微流體的加樣層為兩層以上，從上到下加樣層的加樣孔的直徑逐層縮小，所述樣品區(qū)的直徑小于最下層加樣層的加樣孔的直徑。加樣孔的直徑逐層縮小，使得微流體的中央形成一個由外往內直徑逐漸縮小的孔，減少了樣品被濾紙吸收帶來的損耗。

作為優(yōu)選地，所述步驟2中的紙質微流體的所有反應孔的圓心在同一圓周上，所有反應區(qū)的圓心也在同一圓周上，使得微流體裝置美觀整潔，結果易于觀察統(tǒng)計。

作為優(yōu)選地，所述步驟2中的紙質微流體上的疏水材料為石蠟或者二甲基硅氧烷或者SU-8光阻膠。

作為優(yōu)選地，所述步驟3中加熱紙質微流體的方法為將紙質微流體放入預先調好溫度的人工培養(yǎng)箱中，不需要其它設備，操作簡單。

作為優(yōu)選地，所述步驟2中的紙質微流體還包括位于反應層下方的加熱層，所述加熱層由濾紙制成，其下表面上設有電阻絲，可以連接電阻，接通電流后使紙層溫度達到核酸擴增反應所需溫度。