[發(fā)明專利]利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410528335.0
• 申請(qǐng)日: 2014-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN104293945A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王歡;府偉靈;黃慶;王云霞;張立群;黃君富
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 譚春艷

1.一種利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備待測(cè)樣品DNA溶液；

(2)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目，將相應(yīng)的引物包被在紙質(zhì)微流體的反應(yīng)區(qū)(22)上，所述紙質(zhì)微流體包括由濾紙制成的反應(yīng)層(2)和至少一層加樣層(1)，所述加樣層(1)重疊放置在反應(yīng)層(2)的上方，所述加樣層(1)中心設(shè)有加樣孔(11)，所述加樣層(1)上圍繞加樣孔(11)均布有多個(gè)反應(yīng)孔(12)，所述加樣孔(11)和反應(yīng)孔(12)的孔口上均涂覆有疏水材料；所述反應(yīng)層(2)上設(shè)有由疏水材料畫出的與加樣孔(11)相對(duì)應(yīng)的樣品區(qū)(21)、與反應(yīng)孔(12)對(duì)應(yīng)的多個(gè)反應(yīng)區(qū)(22)以及反應(yīng)通道(23)，所述反應(yīng)區(qū)(22)直徑與反應(yīng)孔(12)的直徑相同，所述樣品區(qū)(21)的直徑小于加樣孔(11)的直徑，每個(gè)反應(yīng)區(qū)(22)通過一個(gè)反應(yīng)通道(23)與樣品區(qū)(21)連通，所述反應(yīng)通道(23)的寬度從反應(yīng)區(qū)(22)到樣品區(qū)(21)逐漸變小；

(3)將步驟1制備的待測(cè)樣品DNA溶液根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目混合成擴(kuò)增反應(yīng)體系，滴加在紙質(zhì)微流體的加樣孔中，加熱紙質(zhì)微流體使其溫度達(dá)到核酸擴(kuò)增所需要的溫度并保持恒溫；

(4)擴(kuò)增反應(yīng)完成后，觀察紙質(zhì)微流體反應(yīng)區(qū)的顏色變化，即可得到檢測(cè)結(jié)果。

2.如權(quán)利要求1所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟2中在紙質(zhì)微流體的反應(yīng)區(qū)(22)上包被引物是通過生物素化引物和親和素化微凝膠偶聯(lián)結(jié)合，室溫干燥沉淀在反應(yīng)區(qū)(22)上。

3.如權(quán)利要求1所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟2中的紙質(zhì)微流體的加樣層(1)為兩層以上，從上到下加樣層(1)的加樣孔(11)的直徑逐層縮小，所述樣品區(qū)(21)的直徑小于最下層加樣層(1)的加樣孔(11)的直徑。

4.如權(quán)利要求1所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟2中的紙質(zhì)微流體的所有反應(yīng)孔(12)的圓心在同一圓周上，所有反應(yīng)區(qū)(22)的圓心也在同一圓周上。

5.如權(quán)利要求1所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟2中的紙質(zhì)微流體上的疏水材料為石蠟或者二甲基硅氧烷或者SU-8光阻膠。

6.如權(quán)利要求1所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟3中加熱紙質(zhì)微流體的方法為將紙質(zhì)微流體放入預(yù)先調(diào)好溫度的人工培養(yǎng)箱中。

7.如權(quán)利要求1所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟2中的紙質(zhì)微流體還包括位于反應(yīng)層(2)下方的加熱層(3)，所述加熱層(3)由濾紙制成，其下表面上設(shè)有電阻絲(31)。

8.如權(quán)利要求7所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟3中加熱紙質(zhì)微流體的方法為電阻絲(31)外接可變電阻，接通電流，調(diào)節(jié)可變電阻，使得紙質(zhì)微流體的溫度達(dá)到擴(kuò)增所需要的溫度。

9.如權(quán)利要求7所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟2中的紙質(zhì)微流體的加熱層(3)的電阻絲(31)為由金屬粉噴射沉淀而成。

10.如權(quán)利要求1～9任一所述的利用紙質(zhì)微流體進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，所述步驟2中的紙質(zhì)微流體的加樣層(1)、反應(yīng)層(2)和加熱層(3)由雙面膠層(4)粘貼疊加固定，其中所述加樣層(1)之間、加樣層(1)與反應(yīng)層(2)之間的雙面膠層(4)上設(shè)有與位于其上方的加樣層(1)的加樣孔(11)和反應(yīng)孔(12)對(duì)應(yīng)的孔。