[發明專利]一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法

有效

• 申請號: 201410526145.5
• 申請日: 2014-10-09
• 公開（公告）號: CN104237439A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 涂宗財;沙小梅;肖輝;王輝;段鄧樂;陳媛;劉光憲
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所 36122
• 代理人: 夏材祥

技術領域

本發明涉及一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法。

背景技術

二硫鍵是由2個巰基被氧化而形成的-S-S-形式的共價鍵。二硫鍵分兩種，即分子內和分子間二硫鍵，分子內二硫鍵存在于單獨的多肽鏈中用來穩固蛋白質的三級結構，而分子間二硫鍵存在于肽鏈之間用來穩定蛋白質的四級結構。二硫鍵的斷裂會促使蛋白質的立體結構發生一定程度的改變，進而影響蛋白質的生物特性及反應活性，例如，二硫鍵的斷裂會加速卵清蛋白發生糖基化反應。目前，人類正不斷嘗試通過某種技術改變蛋白質結構，從而改造其性能。例如，通過超聲波技術可以改變牛血清白蛋白結構，進而加速其發生糖基化反應的速率。蛋白質結構的改變是否和二硫鍵斷裂有關？這一問題的回答有利于指導蛋白質功能性質的定向改造，因此，尋找一種能夠準確檢測蛋白質二硫鍵是否發生斷裂的方法顯得十分必要。

本發明采用碘乙酸與蛋白質中的游離巰基反應，通過超濾去除未反應的碘乙酸，再運用二硫蘇糖醇斷裂蛋白質的二硫鍵產生新的巰基，采用碘乙酰胺與蛋白質中新產生的巰基反應，運用胰蛋白酶將被碘乙酰胺作用后的蛋白質水解成多肽，借助高分辨率質譜檢測多肽的質荷比信息，與天然蛋白質的二硫鍵信息進行對比，確定二硫鍵是否發生斷裂。本發明采用碘乙酸與蛋白質的游離巰基反應、碘乙酰胺與經二硫蘇糖醇斷裂蛋白質二硫鍵得到的巰基反應，運用高分辨率質譜進行檢測，國內外未有文獻進行相關報道。

發明內容

本發明旨在提供一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，采用碘乙酸與蛋白質的游離巰基反應、碘乙酰胺與經二硫蘇糖醇斷裂蛋白質二硫鍵得到的巰基反應，運用高分辨率質譜進行檢測，與天然蛋白質的二硫鍵信息進行比對，確定二硫鍵是否發生斷裂。

其具體工藝步驟如下：

1、蛋白質游離巰基與碘乙酸反應

（1）蛋白質溶液的配制：用10-100mM的碳酸氫氨溶液溶解得到0.1-2.0?mg/ml的蛋白質溶液；

（2）碘乙酸溶液的配制：用超純水配制50-150mM的碘乙酸溶液；

（3）蛋白質游離巰基與碘乙酸反應：將10-30μl蛋白質溶液與3-10μl碘乙酸溶液混合，混勻后，避光放置20-60?min；

（4）去除未參與反應的碘乙酸：采用1000-10000Da的超濾離心管去除未參與反應的多余碘乙酸。

2、二硫蘇糖醇斷裂蛋白質二硫鍵

（1）二硫蘇糖醇溶液配制：用超純水配制50-150mM的二硫蘇糖醇溶液；

（2）二硫蘇糖醇斷裂蛋白質二硫鍵：向蛋白質溶液中加入二硫蘇糖醇溶液2-10μl，50-100℃處理3-30min，冷卻至室溫；

3、碘乙酰胺與經二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應

（1）碘乙酰胺溶液的配制：用超純水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液；

（2）碘乙酰胺與經二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應：向蛋白質溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15μl，混勻后，避光放置20-60?min；

4、胰蛋白酶酶解蛋白質

（1）胰蛋白酶的配制：用超純水配制0.1-1.0mg/ml的胰蛋白酶溶液；

（2）胰蛋白酶酶解蛋白質：按照蛋白質與胰蛋白酶質量比g/g?為100:1-100:1，將胰蛋白酶與蛋白質溶液混合，在30-50℃的搖床中放置8-24h；

（3）中止胰蛋白酶的水解反應：加入1-10%的三氟乙酸2-10μl中止胰蛋白酶的水解反應，得到最終的蛋白質水解混合物。

5、高分辨率質譜檢測

（1）上樣：將2-15μg的蛋白質水解物注射入高效液相色譜儀，脫鹽3-10min；

（2）高分辨率質譜檢測：連接高效液相色譜儀和高分辨率質譜設備，采譜30-60min，記錄蛋白質水解物的質譜信息；

6、數據分析

（1）質譜圖譜分析：整理蛋白質水解產物的質譜信息，碘乙酸與巰基反應會使多肽質量增加57.09-58.02Da，碘乙酰胺與巰基反應會使多肽質量增加57.01-57.03Da；

（2）蛋白質中巰基游離情況分析：根據蛋白質水解物的質荷比增加信息，斷定巰基是與碘乙酸發生反應還是與碘乙酰胺發生反應，若與碘乙酸發生反應則說明蛋白質中的巰基是游離的，若與碘乙酰胺發生反應則說明蛋白質中的巰基是結合的，即以二硫鍵的形式存在；

（3）確定蛋白質中的二硫鍵是否發生斷裂：根據數據庫中天然蛋白質的二硫鍵存在信息，對比實驗中得到的二硫鍵信息，確定蛋白質中的二硫鍵是否發生斷裂。