[發明專利]一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法

有效

• 申請號: 201410526145.5
• 申請日: 2014-10-09
• 公開（公告）號: CN104237439A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 涂宗財;沙小梅;肖輝;王輝;段鄧樂;陳媛;劉光憲
• 申請（專利權）人: 江西師范大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所 36122
• 代理人: 夏材祥

1.一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是：

A、蛋白質游離巰基與碘乙酸反應；

B、二硫蘇糖醇斷裂蛋白質二硫鍵；

C、碘乙酰胺與經二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應；

D、胰蛋白酶酶解蛋白質；

E、高分辨率質譜檢測；

F、數據分析。

2.根據權利要求1所述的一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是：

所述蛋白質游離巰基與碘乙酸反應包括如下步驟：

（1）用10-100mM的碳酸氫氨溶液溶解得到0.1-2.0mg/ml的蛋白質溶液；

（2）用超純水配制50-150mM的碘乙酸溶液；?

（3）將10-30μl蛋白質溶液與3-10μl碘乙酸溶液混合，混勻后，避光放置20-60min；

（4）采用1000-10000?Da的超濾離心管去除未參與反應的多余碘乙酸。

3.根據權利要求1所述的一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是：

所述二硫蘇糖醇斷裂蛋白質二硫鍵包括如下步驟：

（1）用超純水配制50-150mM的二硫蘇糖醇溶液；

（2）向蛋白質溶液中加入二硫蘇糖醇溶液2-10μl，50-100℃處理3-30min，冷卻至室溫。

4.根據權利要求1所述的一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是：

所述碘乙酰胺與經二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應包括如下步驟：

（1）用超純水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液；

（2）向蛋白質溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15μl，混勻后，避光放置20-60min。

5.根據權利要求1所述的一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是：

所述胰蛋白酶酶解蛋白質包括如下步驟：

（1）用超純水配制0.1-1.0mg/ml的胰蛋白酶溶液；

（2）按照蛋白質與胰蛋白酶質量比g/g為?100:1-100:1，將胰蛋白酶與蛋白質溶液混合，在30-50℃的搖床中放置8-24h；

（3）加入1-10%的三氟乙酸2-10μl中止胰蛋白酶的水解反應，得到最終的蛋白質水解混合物。

6.根據權利要求1所述的一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是：

所述高分辨率質譜檢測包括如下步驟：

（1）將2-15μg的蛋白質水解物注射入高效液相色譜儀，脫鹽3-10min；

（2）連接高效液相色譜儀和高分辨率質譜設備，采譜30-60min，記錄蛋白質水解物的質譜信息。

7.根據權利要求1所述的一種檢測蛋白質二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是：

所述數據分析包括如下步驟：

（1）整理蛋白質水解產物的質譜信息，碘乙酸與巰基反應會使多肽質量增加57.09-58.02Da，碘乙酰胺與巰基反應會使多肽質量增加57.01-57.03Da；

（2）根據蛋白質水解物的質荷比增加信息，斷定巰基是與碘乙酸發生反應還是與碘乙酰胺發生反應，若與碘乙酸發生反應則說明蛋白質中的巰基是游離的，若與碘乙酰胺發生反應則說明蛋白質中的巰基是結合的，即以二硫鍵的形式存在；

（3）根據數據庫中天然蛋白質的二硫鍵存在信息，對比實驗中得到的二硫鍵信息，確定蛋白質中的二硫鍵是否發生斷裂。