[發明專利]一種用于DisA表達的pEX-MBP重組質粒

在審

• 申請號: 201410525823.6
• 申請日: 2014-10-09
• 公開（公告）號: CN104293822A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 楊國宇;郭準;王江;王月影;郭豫杰;李和平;朱河水;鐘凱;魯維飛;韓立強;耿娟
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N9/88
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種DisA（DNA?integrity?scanning?protein?A，DNA損傷修復蛋白）表達過程中所使用的重組質粒pEX-MBP及其制備和用途。?

背景技術

DisA（DNA?integrity?scanning?protein?A）是DNA損傷修復蛋白的簡寫，它能夠發現機體的DNA損傷，并且來進行修復，從而保持DNA的完整性。研究發現，它具有二腺嘌呤環化酶（diadenylate?cyclase，DAC）活性，能夠催化兩個ATP生成環二腺嘌呤核苷酸c-di-AMP，c-di-AMP是細菌的第二信使，不但與細胞形態的調控和細胞壁的合成有密切的關系，還與病原菌的致病性和細菌的耐藥性有關，因而，c-di-AMP在免疫學上也有很好的實用價值。

目前在大腸桿菌的蛋白表達系統中，廣泛采用的是T7表達系統（Kang?Y，Son?MS，Hoang?TT.；One?step?engineering?of?T7-expression?strains?for?protein?production：increasing?the?host-range?of?the?T7-expression?system；Protein?Expr?Purif，2007，55?(2)：325~333），它含有T7啟動子，T7啟動子是通過誘導型的啟動子比如lacUV5來調控的，因而宿主必須攜帶T7基因并且能夠編碼T7RNA聚合酶，一般廣泛使用的宿主菌是BL21(DE3)。

T7表達系統表達蛋白過程中，影響蛋白表達效果的一個主要原因是誘導劑的使用。例如常見的以IPTG為誘導劑表達蛋白過程中，lacUV5啟動子在IPTG的誘導作用下使宿主菌表達T7?RNA聚合酶，使T7啟動子與目的蛋白高效率的進行表達。但是由于IPTG成本較高，因而限制了IPTG誘導的T7表達系統在大規模蛋白表達過程中的使用。另外，由于IPTG很難被細菌細胞消化而易使表達的蛋白污染，加之IPTG的毒性作用，因而無法使用IPTG誘導的T7表達系統來表達人類的蛋白?，F有技術中，有研究嘗試采用乳糖代替IPTG作誘導劑，或者使用溫度控制的表達系統來進行蛋白誘導表達的，但也存在各種需要進一步完善的問題（Neubauer?P，Hofmann?K，Holst?O.?et?al.；Maximizing?the?expression?of?a?recombinant?gene?in?Escherichia?coli?by?manipulation?of?induction?time?using?lactose?as?inducer；Appl?Micro-?biol?Biotechnol，1992，36(6)：739~744）。例如，采用溫控表達系統所表達的蛋白易形成包涵體，可溶性蛋白的量僅為總蛋白量的13%。

另一個影響T7表達系統的因素是部分蛋白表達不穩定，這主要是因為T7RNA聚合酶有時候會缺失表達，即使將基因直接放在lacUV5啟動子的后面，RNA聚合酶有時也會缺失表達。因此為了減少RNA聚合酶缺失的影響，研究人員采取了各種措施來防止不誘導時RNA聚合酶的表達，或者在不誘導時來抑制RNA聚合酶的活性，但是效果都不太理想。

為了克服現有T7表達系統存在的一些問題，有研究人員構建了新的T7表達系統，稱為PBAD-T7系統，但它也并不是沒有問題的。該系統是通過阿拉伯糖進行誘導的（Khlebnikov?A，Risa?O，Skaug?T.?et?al.；Regulatable?arabinose-inducible?gene?expression?system?with?consistent?control?in?all?cells?of?a?culture，J?Bacteriol，2000，182(24)：7029~7034），首先的問題是阿拉伯糖不能夠通過細胞膜進行自由擴散，其次阿拉伯糖的價格雖然比IPTG便宜，但是如果要大量表達蛋白的話，代價還是會很高。

現有技術中，關于DisA蛋白的表達仍然采用傳統的T7表達系統，即通過pET28α（+）載體將DisA基因轉入大腸桿菌BL21表達菌株中，這種方法所制備DisA蛋白可溶度較差，而且誘導表達時以IPTG作為誘導劑，存在蛋白制備成本高，無法大量制備的弊端，因而急需開發一種適于DisA蛋白大量表達的表達系統。?

發明內容

本發明目的在于提供一種用于DisA蛋白表達的pEX-MBP重組質粒，通過將該質粒引入T7表達系統，同時結合誘導系統的改變，可以大量制備DisA蛋白。