[發(fā)明專利]一種小分子抑制劑及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410524065.6
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104739836B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王艷林;劉森;占景瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 三峽大學(xué)
• 主分類號: A61K31/517
• 分類號: A61K31/517;A61P35/00;A61P31/00
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務(wù)所42103
• 代理人: 彭永念

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鳥氨酸脫羧酶(Ornithine?decarboxylase；ODC)的小分子抑制劑及其應(yīng)用，具體涉及人源鳥氨酸脫羧酶的小分子抑制劑及其在抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)是生物體的主要組成成分之一，是完成各種生命活動的主要物質(zhì)。在各種蛋白質(zhì)中，蛋白酶對生命活動至關(guān)重要，幾乎所有生物體內(nèi)的生化反應(yīng)過程都由蛋白酶進(jìn)行催化。生物體內(nèi)各種蛋白酶的活性具有嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，一旦其調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)問題，造成蛋白酶的活性過高、過低或者是完全失活，都會造成相應(yīng)的各類疾病。因此，通過藥物來調(diào)控蛋白酶的活性，使其恢復(fù)和保持在正常水平，具有非常重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)，是設(shè)計(jì)以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的藥物的一個非常重要的手段。

多胺(polyamines)是一類從氨基酸代謝產(chǎn)生的帶正電的陽離子小分子，在所有生物體中都存在，對細(xì)胞生長、分化、存活及正常生物學(xué)功能等都不可缺少。多胺帶多正電荷的特性，使它們能通過與帶負(fù)電荷的生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等)形成靜電作用，從而調(diào)控非常廣泛的生物學(xué)過程，包括染色體結(jié)構(gòu)形成、DNA合成與穩(wěn)定、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)磷酸化、核糖體生成、離子通道和膜表面受體的調(diào)控、自由基清除等。天然的多胺有很多種。在哺乳動物中，天然存在的有三種，即腐胺(putrescine)，精脒(spermidine)，精胺(spermine)，它們對哺乳動物正常生長和發(fā)育必不可少。由于多胺具有重要的生物學(xué)功能，其細(xì)胞內(nèi)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控。在快速繁殖的細(xì)胞中，如腫瘤細(xì)胞，多胺水平及ODC表達(dá)水平也會上升和失調(diào)。多胺水平升高，伴隨著細(xì)胞增殖加快、凋亡減少、以及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平升高等。因此，多胺的調(diào)控，成為腫瘤治療和藥物研發(fā)中的一個重要手段。

多胺代謝的起始底物是鳥氨酸(ornithine)，它是精氨酸在尿素循環(huán)(urea?cycle)中被精氨酸酶(arginase)催化的反應(yīng)產(chǎn)物。ODC是多胺合成途徑的第一個酶，催化從鳥氨酸(ornithine)到腐胺的反應(yīng)，該步催化反應(yīng)也是多胺合成途徑的一個限速步驟。因此，合成ODC抑制劑，抑制腐胺的生成，是目前很受關(guān)注的一個腫瘤治療途徑。同時，由于病原微生物也需要正常的多胺水平，ODC抑制劑也成為針對病原微生物(如導(dǎo)致非洲錐蟲病的布氏錐蟲)的重要靶標(biāo)。

當(dāng)前，ODC的抑制劑DFMO(α-二氟甲基鳥氨酸)已經(jīng)被用于臨床，輔助癌癥的化療。但其與ODC的結(jié)合能力較弱，作用濃度很高，且由于是與ODC形成共價鍵的自殺性抑制劑，毒副作用非常大。因此，非常有必要開發(fā)出具有更好效果的ODC新型抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是通過計(jì)算機(jī)輔助的高通量藥物篩選，提供一種針對ODC的新型小分子抑制劑，將其應(yīng)用于鳥氨酸脫羧酶的抑制劑，可以用于制備治療腫瘤、病原微生物感染的藥物。

一種小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

其中，R₁為或

進(jìn)一步優(yōu)選為

采用上述任意一種小分子抑制劑在抑制鳥氨酸脫羧酶(ODC)上的應(yīng)用。

采用上述任意一種小分子抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

采用上述任意一種小分子抑制劑在制備治療病原微生物感染藥物中的應(yīng)用。

將上述小分子抑制劑用于抑制鳥氨酸脫羧酶(ODC)的方法，包括如下步驟：

1)ODC原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將ODC的基因序列，通過BamH?I和Xho?I酶切位點(diǎn)，插入到pET28a質(zhì)粒中，構(gòu)建出pET28a-hODC質(zhì)粒，經(jīng)DNA測序驗(yàn)證；

2)ODC蛋白的表達(dá)

將步驟1)構(gòu)建的pET28a-hODC質(zhì)粒通過CaCl₂法，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，通過卡那霉素進(jìn)行篩選，然后將在含有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)板上生長的菌株，接種至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至0.5mM，在28℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時，最后，離心收集細(xì)菌；

3)ODC蛋白的純化