[發(fā)明專利]一種小分子抑制劑及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410524065.6
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104739836B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王艷林;劉森;占景瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 三峽大學(xué)
• 主分類號: A61K31/517
• 分類號: A61K31/517;A61P35/00;A61P31/00
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務(wù)所42103
• 代理人: 彭永念

1.一種小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

其中，R₁為-C≡N、-R-C≡N或

2.權(quán)利要求1所述的小分子抑制劑，其特征在于，該小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)式為：

3.權(quán)利要求1所述的小分子抑制劑在抑制鳥氨酸脫羧酶(ODC)上的應(yīng)用。

4.權(quán)利要求1中所述的小分子抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1中所述的抑制劑在制備治療病原微生物感染藥物中的應(yīng)用。

6.權(quán)利要求1所述的小分子抑制劑抑制鳥氨酸脫羧酶(ODC)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)ODC原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將ODC的基因序列，通過BamH?I和Xho?I酶切位點，插入到pET28a質(zhì)粒中，構(gòu)建出pET28a-hODC質(zhì)粒，經(jīng)DNA測序驗證；

2)ODC蛋白的表達

將步驟1)構(gòu)建的pET28a-hODC質(zhì)粒通過CaCl2法，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，通過卡那霉素進行篩選，然后將在含有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)板上生長的菌株，接種至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至0.5mM，在28℃誘導(dǎo)表達4小時，最后，離心收集細(xì)菌；

3)ODC蛋白的純化

將步驟2)中收集的細(xì)菌，用裂解液重新懸浮，然后通過超聲方法進行細(xì)胞裂解，再將裂解液在4℃、12000轉(zhuǎn)/min，離心后，保留上清；最后將上清利用Ni-NTA?His標(biāo)簽蛋白結(jié)合填料進行結(jié)合和純化，得到ODC蛋白，ODC蛋白的洗脫緩沖液為50mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)/HCl,pH?8.0，300mM?NaCl，1mM?DTT，100mM咪唑(imidazole)；

4)ODC蛋白的活性檢測

在EP管中，加入400uL底物反應(yīng)混合物、50ug的ODC蛋白，混勻后將EP管放置在37℃水浴中30min；加入400uL?10％的三氯乙酸終止反應(yīng)，室溫離心5000rpm、5min，然后取出100uL上清，與200uL?4mol/L的NaOH溶液混合，加入400uL正戊醇，充分混合，2000rpm離心5min，再將上層液200uL轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入200uL0.1mol/LpH為8.0的四硼酸鈉混合均勻、加入200uL10mmol/L三硝基苯磺酸混合充分、加入400uL?DMSO，充分混合1min，3000rpm離心5min；最后取出上層液到96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測426nm處的吸光值，得到未加酶的OD值

5)抑制劑對ODC蛋白的抑制活性的檢測

根據(jù)步驟4)中所述的方法，在加入400uL底物反應(yīng)混合物后，隨即加入鳥氨酸脫羧酶的小分子抑制劑，后續(xù)操作同步驟4)；

通過以下公式計算出ODC抑制率：

對照差＝加小分子抑制劑對照組平均OD值-未加小分子抑制劑對照組平均OD值，其中對照組在步驟5)中加入的抑制劑為DFMO抑制劑；

實驗差＝加小分子抑制劑實驗組平均OD值-未加小分子抑制劑實驗組組平均OD值；

ODC抑制率＝[(對照差-實驗差)/對照差]×100％。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：步驟3)中所述的裂解液為50mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)/HCl,pH?8.0，300mM?NaCl，1mM?DTT，1mM?PMSF，5mM咪唑(imidazole)的混合液。

8.據(jù)權(quán)利要求6或7中所述的方法，其特征在于：步驟4)中的底物反應(yīng)混合物為在150mM?pH為7.1的磷酸鹽緩沖液(PBS)中溶解17.57ulβ-巰基乙醇，55.84mg?1.5mM?EDTA二鹽鈉，75nM磷酸吡哆醛(PLP)儲液，2mM鳥氨酸鹽酸鹽。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述的鳥氨酸脫羧酶為人源鳥氨酸脫羧酶、非人源鳥氨酸脫羧酶或與人源鳥氨酸脫羧酶的腐胺底物及磷酸吡哆醛結(jié)合位點高度同源的蛋白質(zhì)。