[發明專利]一種無創人肝癌早期檢測與鑒別診斷方法及系統

無效

• 申請號: 201410522229.1
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104313136A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 朱克卿;邢同京;徐洪濤;徐祖龍;朱霞;胡月;薄世平;陸思嘉;王春香
• 申請（專利權）人: 江蘇億康基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及對離體血液檢測實現無創肝癌早期檢測與鑒別診斷的分子檢測方法，屬于臨床醫學領域。

背景技術

肝癌是世界上第五常見腫瘤，第二常見腫瘤死因。小肝癌手術后生存率可以達80％以上，但一般病人診斷時已經屬晚期，生存率往往不到6個月，因此及時準確盡早診斷肝癌是提高肝癌病人生存率的首要工作。由于肝癌常常發生在慢性肝炎肝硬化的基礎上，早期區分一般不容易，因此傳統的檢測方法在肝癌的早期檢測，鑒別診斷，早期治療上存在很多缺陷，尤其是無法準確的區分慢性肝炎肝硬化與肝癌。

腫瘤檢測常規使用血清學檢測，影像學檢查，及病理檢查等手段。血清學檢測往往缺乏特異性，影像學檢查有時也不能做早期診斷，或性質診斷，病理檢查是有創檢查，一般也不能做早期診斷。

發明內容

申請人對肝癌的早期檢測進行了深入研究，將肝癌與腫瘤細胞在染色體水平上在基因水平上的異常改變進行關聯分析從而發明了一種無需在人體上進行有創檢查的肝癌早期檢測與鑒別診斷方法。

具體地說，本發明是通過下述技術方案實現的：

一種無創人肝癌早期檢測與鑒別診斷方法，包括下述步驟：

1)從離體血漿中提取血漿游離DNA，構建基因組測序文庫；

2)對其進行測序，測定基因組DNA順序并與人基因組參考順序進行序列比對；

3)以不同的基因組順序長度為基本分析單元，進行染色體拷貝數變異CNV分析并構建染色體CNV圖觀察是否有目視可觀察到的拷貝數改變。

4)以不同的基因組順序長度為基本分析單元，進行染色體拷貝數變異Z分值CNV的分析。

其中，上述的離體血漿，通常是外周血血漿。

其中，基本分析單元為0.05-5.0M的基因組順序長度，優選是0.05-3.0Mb之間或0.1-5.0Mb之間，最優選為150kb或1Mb。

其中，上述所用的測序方法可以是本領域任意可用的方法，為了提高靈敏度、準確率和速度，優選為高通量基因組測序。

在本發明中，涉及到的基因文庫構建、測序、比對等都可從市場上采購相應的產品，例如NEB公司的試劑盒構建基因組測序文庫、Illumina?Hiseq2500SR41方法做基因組DNA測序、BWA軟件做測序順序比對等。

其中，步驟3)的操作為使用基因組測序數據測得的小片段數，按核酸GC含量做標準化處理，計算每個染色體上每個基本分析單元測得的相對片段數，再與正常人對照組比較，計算CNV比值；將各染色體各基本分析單元的CNV比值與染色體位置作CNV圖。

其中，步驟4)是為了進一步提高微小CNV的檢出率，其具體操作為將樣品每個基本分析單元與正常人對照組相比，以均數差與對照組標準差之間的比例關系，計算樣品基本分析單元測得順序片段數的偏離正常群體的程度從而進行Z分值CNV分析。

Z分值CNV改變的判斷標準為：一條染色體的長臂或短臂有兩個或兩個以上的基本分析單元Z分值或都大于4.0或都小于負4.0，或一個基本分析單元Z分值大于4.0或小于負4.0同時有其它4個基本分析單元Z分值或都大于3.0或都小于負3.0(同向)。上述界定值4.0也可以是3.0到6.0之間的其它數值。符合這個標準的Z分值CNV改變出現在人染色體1q或7q或19q，表現為拷貝數增加，或同時出現在人染色體1p，9q，14q，表現為拷貝數減少。

申請人進行的大量研究發現，上述特有性的染色體CNV改變常見于肝癌病人及早期肝癌病人的樣品中，包括一些血清AFP正常或比較低的肝癌病人的樣品中，而在慢性肝炎，肝硬化病人的樣品中沒有或極少見，因此本發明可用于在慢性肝炎，肝硬化病人中篩查，作為肝癌的早期檢測及鑒別診斷方法。CNV綜合評分高提示病人肝癌的存在的可能性高，特別是在慢性肝炎肝硬化的基礎上，需要密切追蹤觀察，結合其它方法驗證肝癌的存在，以達到早期診斷，早期治療的目的。

最后，為了提高上述整個過程的自動化程度，降低人為的操作誤差，本發明還公開了一種無創人肝癌早期檢測與鑒別診斷系統，包括試劑盒、DNA測序儀和計算機，所述試劑盒用來對提取的血漿游離DNA構建基因組測序文庫，所述DNA測序儀進行基因組DNA測序；所述計算機基于測序數據進行CNV分析并構建染色體CNV圖和進行Z分值CNV分析并輸出分析結果。