[發明專利]構建測序文庫的方法及其應用

有效

• 申請號: 201410521540.4
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104293940B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 管彥芳;錢朝陽;呂小星;常連鵬;易鑫;朱紅梅;楊玲;吳仁花
• 申請（專利權）人: 天津華大基因科技有限公司;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/34;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及生物醫學領域。具體而言，本發明涉及構建測序文庫的方法、測序方法、確定核酸序列的方法、構建測序文庫的裝置、測序設備以及確定核酸序列的系統。

背景技術

高通量測序日益被關注，但是目前高通量測序用于低頻率突變的檢測仍有待改進。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，根據本發明的實施例，本發明提出了用于構建測序文庫的方法以及檢測低頻率突變的手段。

在本發明的第一方面，本發明提出了一種構建測序文庫的方法。根據本發明的實施例，該方法包括：(a)在雙鏈DNA片段的兩端分別連接接頭，以便獲得連接產物，其中，所述接頭包括第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和第二鏈部分匹配并且所述第一鏈包含第一標簽序列，以便所述接頭上限定出雙鏈區和兩個單鏈尾部，所述兩個單鏈尾部之一的序列中包含第一標簽；(b)將所述連接產物裂解為單鏈DNA片段；(c)利用探針對所述單鏈DNA片段進行篩選，其中，所述探針特異性識別預定區域，其中，所述預定區域包括下列之一：(1)表1所示基因的至少之一；(2)(1)的CDS區域；以及(3)(2)的上下游至少10bp的區域；(d)利用第一引物對所述單鏈DNA片段進行鏈延伸反應，以便獲得鏈延伸產物，其中，所述第一引物包括第二標簽序列，并且所述第一引物適于與所述接頭的第一鏈形成雙鏈結構，只是所述第一標簽序列與所述第二標簽序列之間存在錯配；(e)對所述鏈延伸產物進行擴增，以便獲得擴增產物，所述擴增產物構成所述測序文庫，其中，所述擴增采用適于同時擴增所述第一標簽序列和所述第二標簽序列的引物。。

由此，利用根據本發明實施例的構建測序文庫的方法，能夠有效地構建測序文庫，同時，所構建的測序文庫中，針對相同的雙鏈DNA片段(在本文中也被稱為“源序列”)的每條鏈，分別獲得了具有第一標簽序列和第二標簽序列的擴增產物，由此，在后續測序結果的分析中，可以依據兩種標簽的測序結果進行互相校正，提高分析結果的可靠性。

根據本發明的實施例，所述雙鏈DNA片段是通過下列步驟獲得的：將核酸樣本進行末端修復，以便獲得經過修復的核酸樣本；以及在所述核酸樣本的5’末端添加堿基A，以便獲得兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本，所述兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本構成所述雙鏈DNA片段。由此，可以在后續操作中，方便地在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭。從而，提高了構建測序文庫的效率。

根據本發明的實施例，所述核酸樣本為人基因組DNA的至少一部分或游離核酸。根據本發明的實施例，所述人游離核酸是從患者的外周血提取的。根據本發明的實施例，所述患者患有結直腸癌。由此，利用本發明實施例的方法，能夠有效地對人類疾病患者的基因突變進行有效的分析，進而能夠有效用于結直腸癌的早診、個體化用藥、以及術后監控等。

根據本發明的實施例，所述人基因組DNA的至少一部分是通過對人基因組DNA進行隨機打斷而獲得的。由此，可以在后續操作中，方便地在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭。從而，提高了構建測序文庫的效率。

根據本發明的實施例，所述接頭具有3’堿基T粘性末端。由此，可以在后續操作中，方便地在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭。從而，提高了構建測序文庫的效率。

根據本發明的實施例，所述單鏈DNA片段是通過將所述連接產物進行變性處理獲得的。由此，可以快速有效的獲得單鏈DNA片段。根據本發明的一些實施例，所述變性處理可以為熱變性處理或堿變性處理。

根據本發明的實施例，所述探針是以芯片的形式提供的。由此，可以提高探針篩選的效率。

根據本發明的實施例，在存在UDG酶/FPG酶時，進行所述鏈延伸反應。由此，可以有效地對存在損傷的DNA在鏈延伸過程中進行修復，減少假陽性的產生，提高構建測序文庫的質量。

根據本發明的實施例，所述第一標簽序列和所述第二標簽序列分別獨立地長度為4～10nt。根據本發明的實施例，所述第一標簽序列和所述第二標簽序列的長度均為8nt。根據本發明的實施例，所述第一標簽序列和所述第二標簽序列之間存在至少2nt的錯配。發明人驚奇地發現，采用如此設置，能夠有效地提高在后續分析中，利用第一標簽序列和第二標簽序列進行校正的效率。