[發(fā)明專利]構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410521540.4
• 申請(qǐng)日: 2014-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN104293940B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管彥芳;錢朝陽(yáng);呂小星;常連鵬;易鑫;朱紅梅;楊玲;吳仁花
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津華大基因科技有限公司;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12M1/34;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

1.一種構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的方法，其特征在于，包括：

(a)在雙鏈DNA片段的兩端分別連接接頭，以便獲得連接產(chǎn)物，其中，所述接頭包括第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和第二鏈部分匹配并且所述第一鏈包含第一標(biāo)簽序列，以便所述接頭上限定出雙鏈區(qū)和兩個(gè)單鏈尾部，所述兩個(gè)單鏈尾部之一的序列中包含第一標(biāo)簽；

(b)將所述連接產(chǎn)物裂解為單鏈DNA片段；

(c)利用探針對(duì)所述單鏈DNA片段進(jìn)行篩選，其中，所述探針特異性識(shí)別預(yù)定區(qū)域，其中，所述預(yù)定區(qū)域包括下列之一：

(1)TLR3、TMPRSS13、MC4R、PHF2、OPRD1、FLG、LILRB5、LIG1、CASD1、COL18A1、LARP4B、ADAMTS18、IRF5、DMKN、DOCK3、MYOM1、KCNN3和NEFH基因的至少之一；

(2)(1)的CDS區(qū)域；以及

(3)(2)的上下游至少10bp的區(qū)域；

(d)利用第一引物對(duì)所述單鏈DNA片段進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，以便獲得鏈延伸產(chǎn)物，其中，所述第一引物包括第二標(biāo)簽序列，并且所述第一引物適于與所述接頭的第一鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，只是所述第一標(biāo)簽序列與所述第二標(biāo)簽序列之間存在錯(cuò)配；

(e)對(duì)所述鏈延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成所述測(cè)序文庫(kù)，其中，所述擴(kuò)增采用適于同時(shí)擴(kuò)增所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列的引物，所述引物為第二引物和第三引物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述雙鏈DNA片段是通過(guò)下列步驟獲得的：

將核酸樣本進(jìn)行末端修復(fù)，以便獲得經(jīng)過(guò)修復(fù)的核酸樣本；以及

在所述核酸樣本的5’末端添加堿基A，以便獲得兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本，所述兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本構(gòu)成所述雙鏈DNA片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸樣本為人基因組DNA的至少一部分或游離核酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述游離核酸是從患者的外周血提取的。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述患者患有結(jié)直腸癌。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述人基因組DNA的至少一部分是通過(guò)對(duì)人基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)打斷而獲得的。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接頭具有3’堿基T粘性末端。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈DNA片段是通過(guò)將所述連接產(chǎn)物進(jìn)行變性處理獲得的。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針是以芯片的形式提供的。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在存在UDG酶/FPG酶時(shí)，進(jìn)行所述鏈延伸反應(yīng)。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列分別獨(dú)立地長(zhǎng)度為4～10nt。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列的長(zhǎng)度均為8nt。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列之間存在至少2nt的錯(cuò)配。

14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接頭的第一鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示的序列，所述接頭的第二鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO：2所示的序列，所述第一標(biāo)簽的核苷酸序列為SEQ ID NO：3-6中至少之一所示的序列，所述第二標(biāo)簽的核苷酸序列為SEQ ID NO：7-10中至少之一所示的序列，所述第一引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：11所示的序列，所述第二引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：12所示的序列，所述第三引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：13所示的序列。

15.一種測(cè)序方法，所述方法用于非診斷目的，其特征在于，包括：

根據(jù)權(quán)利要求1～14任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；

對(duì)所述測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在Hiseq2000或Hiseq2500上進(jìn)行所述測(cè)序。