[發明專利]轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用

在審

• 申請號: 201410521124.4
• 申請日: 2014-10-08
• 公開（公告）號: CN104357422A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 宋春嬌;茹國美;張偉光;楊萬雷
• 申請（專利權）人: 紹興市人民醫院
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/85
• 代理公司: 紹興市越興專利事務所 33220
• 代理人: 沈蘭蘭

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體為轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用，尤其為應用于人類miRNAs基因的敲除。?

背景技術

基因組靶向修飾是近年來生命科學研究的熱點之一，特別是在基因治療人類疾病方面，基因組靶向修飾具有廣闊的應用前景。通過轉基因或者基因敲除等操作改變基因的遺傳組成，獲得滿足各種需要的基因工程工具。傳統較常用的轉基因方法為質粒穩定轉染法、反轉錄病毒攜帶法和同源重組法。但質粒轉染穩定篩選的插入位點隨機，且需要抗生素維持，容易導致非正常的細胞表型；而反轉錄病毒攜帶目的基因的效率雖高，但是插入位點不確定，影響其它內源基因的表達，限制了該方法的應用；另外，同源重組法雖然可以定點插入，但是成功率很低（重組概率為10^-6-10^-7）。?

目前，基因組工程學中的三大利器為：ZFN（Zinc?Finger?Nucleases）、TALEN（Transcription?Activator-like?Effector?Nuclease）和CRISPR/Cas9。?

ZFN是指鋅指蛋白，是轉錄因子，每個模塊識別3-4個堿基序列，將這些模塊混合搭配，可以靶定任何序列，然后，通過C末端的Fok?I核酸內切酶結構域可以切斷雙鏈DNA分子。Sangamo生物科學公司和Sigma-?Aldrich公司已經將ZFN技術商業化，推出CompoZr??ZFN平臺。但是，由于鋅指蛋白之間存在相互作用，鋅指模塊與DNA序列之間沒有一個簡單的對應關系，所以以鋅指蛋白為基礎設計針對序列特異性DNA結合蛋白依然是個難題，并且花費昂貴，經常要做大規模的篩選，構建過程長達幾周至數月。?

CRISPR/Cas9系統是由短的向導RNA介導，Cas9核酸酶在特定的雙鏈DNA位點上產生斷裂。CRISPR/Cas可通過添加多個向導RNA而實現多重編輯。然而，由于向導RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的序列短，致使脫靶效應高。但Church最近發現，通過利用Cas9的一種突變形式（只切割單鏈DNA）和兩個緊挨著的向導RNA，有可能大大提高系統的切割位點保真性，降低脫靶效應。?

TALEN技術是一種嶄新的分子生物學工具。TALEN是轉錄激活樣效應因子，來源于黃單胞桿菌。利用TALEN蛋白的核酸結合結構域的氨基酸序列與核酸序列有恒定的對應關系，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，再通過添加非特異內切酶Fok?I結構域，TALEN蛋白在理論上可以靶向切割任意基因組DNA雙鏈。TALEN蛋白中DNA結合域為高度保守的重復單元，每個重復單元含有34個氨基酸，除了第12和13位氨基酸變化外，其它氨基酸都是相同的，這兩個可變氨基酸被稱為重復序列可變的雙氨基酸殘基（repeatvariable?di-residues，RVD），與堿基識別相關。TALEN識別DNA的機制在于每個重復序列的RVD可以特異識別DNA的1個堿基，HD特異識別C堿基，NI識別A堿基，NN識別G堿基，NG識別T堿基。另外，通過對天然TALEN的研究發現，TALEN蛋白框架固定識別1個T堿基，所以TALEN的識別序列總是以T堿基開始。?

在真核細胞內，TALEN切割的雙鏈DNA，可以激活兩條保守的DNA修復通路。非同源末端連接修復（non-homologous?end?joining，NHEJ），細胞基本上磨平斷裂DNA的兩端，再將其彼此拉近，將斷裂的染色體重新連接，這個過程往往產生移碼，或者在斷裂位點引進小片段插入或刪除，影響基因功能或產生基因敲除效應。同源指導修復（homology-directed?repair，HDR）是指利用相似序列的DNA供體模板，代替斷裂點周圍的DNA序列，從而實現特定突變或導入外源DNA序列的目的。在本發明專利中，采用攜帶同源模板的pMD18載體共同轉染細胞系的方法，使細胞基因組在TALEN切斷雙鏈DNA分子時，利用pMD18載體提供的同源序列，高效精確地對基因組進行編輯。?

TALEN技術可以廣泛的應用于基因組編輯的各個方面：細胞水平的基因敲除，定點突變，結構域缺失，定點整合等等，在疾病治療領域具有廣泛的應用前景。目前TALEN?技術主要的缺陷是效率相對較低，一般在5%-20%，無法直接獲取100%編輯的細胞，只能通過挑選陽性的單克隆細胞，擴增成為穩定株。?