[發明專利]轉錄激活子樣效應因子核酸酶及其編碼基因與應用

在審

• 申請號: 201410521124.4
• 申請日: 2014-10-08
• 公開（公告）號: CN104357422A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 宋春嬌;茹國美;張偉光;楊萬雷
• 申請（專利權）人: 紹興市人民醫院
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/85
• 代理公司: 紹興市越興專利事務所 33220
• 代理人: 沈蘭蘭

1.一種轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：包括3對短肽，所述的3對短肽分別為第一對短肽、第二對短肽和第三對短肽，所述第一對短肽識別SEQ?ID?NO.?1和SEQ?ID?NO.?2的DNA序列，所述第二對短肽識別SEQ?ID?NO.?3和SEQ?ID?NO.?4的DNA序列，所述第三對短肽識別SEQ?ID?NO.?5和SEQ?ID?NO.?6的DNA序列。

2.如權利要求1所述的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：所述的短肽由分別識別人類miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相應堿基的TALENs識別模塊依序連接而成；識別堿基A的TALENs識別模塊為NI，識別堿基T的TALENs識別模塊為NG，識別堿基C的TALENs識別模塊為HD，識別堿基G的TALENs識別模塊為NK。

3.如權利要求1所述的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：包括第一對蛋白質、第二對蛋白質和第三對蛋白質，所述第一對蛋白質由第一對短肽兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成，所述第二對蛋白質由第二對短肽兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成，所述第三對蛋白質由第三對短肽兩端分別加上轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端組成；所述的轉錄激活子樣效應因子氨基酸序列框架的N端和C端均為天然的或經過人工改造的序列。

4.如權利要求3所述的轉錄激活子樣效應因子核酸酶，其特征在于：包括第一對融合蛋白、第二對融合蛋白和第三對融合蛋白，所述第一對融合蛋白由第一對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成，所述第二對融合蛋白由第二對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成，所述第三對融合蛋白由第三對蛋白質與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成；所述的DNA切割蛋白為天然的或經過人工改造的Fok?I?DNA內切酶。

5.一種如權利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體的編碼包含一對短肽或蛋白質中的任意一條的載體。

6.如權利要求5所述的重組載體，其特征在于：將能夠特異性識別SEQ?ID?NO.?1—SEQ?ID?NO.?6堿基序列的多核苷酸連接到載體pEF1a-NLS-TALEN?backbone-Fok1?(R)-pA或載體pEF1a-NLS-TALEN?backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA?上，構建獲得包含編碼轉錄激活子樣效應因子核酸酶基因的質粒載體，能表達轉錄激活子樣效應因子核酸酶。

7.一種如權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為人離體細胞，所述的人離體細胞為人RWPE-1細胞，且宿主細胞含有重組載體。

8.一種如權利要求7所述的重組載體在對人miR-133b、?miR-141和miR-488基因靶向修飾中的應用。

9.一種如權利要求8所述人類miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：將重組載體轉入人離體細胞，于37℃擴增培養1-4天，得到miRNAs基因被靶向修飾的細胞。

10.如權利要求9所述人類miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：所述人離體細胞中轉入有抗puro蛋白或能表達抗puro蛋白的質粒，便于篩選。