[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶及其編碼基因與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410521124.4
• 申請(qǐng)日: 2014-10-08
• 公開（公告）號(hào): CN104357422A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋春嬌;茹國(guó)美;張偉光;楊萬(wàn)雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 紹興市人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/55;C12N15/85
• 代理公司: 紹興市越興專利事務(wù)所 33220
• 代理人: 沈蘭蘭

1.一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶，其特征在于：包括3對(duì)短肽，所述的3對(duì)短肽分別為第一對(duì)短肽、第二對(duì)短肽和第三對(duì)短肽，所述第一對(duì)短肽識(shí)別SEQ?ID?NO.?1和SEQ?ID?NO.?2的DNA序列，所述第二對(duì)短肽識(shí)別SEQ?ID?NO.?3和SEQ?ID?NO.?4的DNA序列，所述第三對(duì)短肽識(shí)別SEQ?ID?NO.?5和SEQ?ID?NO.?6的DNA序列。

2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶，其特征在于：所述的短肽由分別識(shí)別人類miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相應(yīng)堿基的TALENs識(shí)別模塊依序連接而成；識(shí)別堿基A的TALENs識(shí)別模塊為NI，識(shí)別堿基T的TALENs識(shí)別模塊為NG，識(shí)別堿基C的TALENs識(shí)別模塊為HD，識(shí)別堿基G的TALENs識(shí)別模塊為NK。

3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶，其特征在于：包括第一對(duì)蛋白質(zhì)、第二對(duì)蛋白質(zhì)和第三對(duì)蛋白質(zhì)，所述第一對(duì)蛋白質(zhì)由第一對(duì)短肽兩端分別加上轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端組成，所述第二對(duì)蛋白質(zhì)由第二對(duì)短肽兩端分別加上轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端組成，所述第三對(duì)蛋白質(zhì)由第三對(duì)短肽兩端分別加上轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端組成；所述的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端均為天然的或經(jīng)過(guò)人工改造的序列。

4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶，其特征在于：包括第一對(duì)融合蛋白、第二對(duì)融合蛋白和第三對(duì)融合蛋白，所述第一對(duì)融合蛋白由第一對(duì)蛋白質(zhì)與DNA切割蛋白的二個(gè)亞基融合而成，所述第二對(duì)融合蛋白由第二對(duì)蛋白質(zhì)與DNA切割蛋白的二個(gè)亞基融合而成，所述第三對(duì)融合蛋白由第三對(duì)蛋白質(zhì)與DNA切割蛋白的二個(gè)亞基融合而成；所述的DNA切割蛋白為天然的或經(jīng)過(guò)人工改造的Fok?I?DNA內(nèi)切酶。

5.一種如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體的編碼包含一對(duì)短肽或蛋白質(zhì)中的任意一條的載體。

6.如權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于：將能夠特異性識(shí)別SEQ?ID?NO.?1—SEQ?ID?NO.?6堿基序列的多核苷酸連接到載體pEF1a-NLS-TALEN?backbone-Fok1?(R)-pA或載體pEF1a-NLS-TALEN?backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA?上，構(gòu)建獲得包含編碼轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶基因的質(zhì)粒載體，能表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶。

7.一種如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為人離體細(xì)胞，所述的人離體細(xì)胞為人RWPE-1細(xì)胞，且宿主細(xì)胞含有重組載體。

8.一種如權(quán)利要求7所述的重組載體在對(duì)人miR-133b、?miR-141和miR-488基因靶向修飾中的應(yīng)用。

9.一種如權(quán)利要求8所述人類miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：將重組載體轉(zhuǎn)入人離體細(xì)胞，于37℃擴(kuò)增培養(yǎng)1-4天，得到miRNAs基因被靶向修飾的細(xì)胞。

10.如權(quán)利要求9所述人類miRNAs基因打靶的方法，其特征在于：所述人離體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入有抗puro蛋白或能表達(dá)抗puro蛋白的質(zhì)粒，便于篩選。