[發明專利]制備頭孢菌素C的發酵方法和該方法中使用的發酵培養基

有效

• 申請號: 201410519492.5
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104263792B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 苗瑞春;彭亮亮;馮濤;李樹有;任廣宏;張虎
• 申請（專利權）人: 國藥集團威奇達藥業有限公司
• 主分類號: C12P35/06
• 分類號: C12P35/06;C12R1/75
• 代理公司: 北京鴻元知識產權代理有限公司11327
• 代理人: 黃麗娟

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種制備頭孢菌素C的發酵方法以及在該發酵方法中使用的發酵培養基。

背景技術

頭孢菌素C是頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)的代謝產物，是繼青霉素之后的又一重要的β-內酰胺類抗生素，其結構式如下：

頭孢菌素C作為頭孢類抗生素半合成的前體物質，其生產水平決定著頭孢類抗生素的市場供應量，對制備頭孢菌素C的發酵方法的深入研究和工藝優化，有著重要的社會和經濟意義。例如，優化發酵工藝，可以提高發酵效價，進而提高生產效率，降低生產成本。

對制備頭孢菌素C發酵水平的影響因素主要包括發酵培養基、菌種、過程控制等，其中菌種的生產能力是最顯著的影響因素，但菌種改進存在基因改造技術難度大，自然、誘變選育概率低、篩選周期長等缺陷，因此對于工業生產最有效的方式是最大限度地發掘已擁有菌種的生產能力，從發酵培養基和過程工藝條件、補料控制等著手。

目前國內外采用的發酵培養基主要為半合成培養基，除了部分無機鹽外，還包括植物油、花生餅粉、淀粉、糊精和蛋氨酸等半合成有機原料，這些物料或作為碳源、或作為氮源、或作為微量元素的供應體，或兼有以上作用。總而言之頭孢菌素C的發酵培養基成分復雜，如何調配這些物料最大限度地滿足頂頭孢霉菌體增殖和合成頭孢菌素C是發酵培養基優化的原則。

此外，在發酵培養頭孢菌素C的過程中，碳、氮源的補加時間和補加量對頂頭孢霉合成頭孢菌素C的速率起著重要作用。

段生兵等(“混合碳源發酵生產頭孢菌素C過程優化”，工業微生物，2014,44(2)：1-6)采用含有淀粉、玉米漿、糊精、蛋氨酸、尿素、硫酸銨等物質的初始培養基，按照DO-state混合碳源流加策略，在發酵過程中補加混合碳源(葡萄糖+豆油)，發酵190h，頭孢菌素C濃度達到36990μg/mL。

現有文獻報道的頭孢菌素C發酵方法發酵周期長，發酵效價不高，難以滿足工業化要求。

L-α-氨基己二酸是一種氨基酸，其與半胱氨酸、纈氨酸共同組成頭孢菌素C合成的前體物質，它們在三肽合成酶(ACV合成酶)的作用下縮合成δ-L-α-氨基己二酰-L-半胱氨酰-D-纈氨酸(LLD-ACV)三肽，參與到頭孢菌素C的合成途徑中，而ACV合成酶是其中的限速酶。L-α-氨基己二酸對ACV合成酶的影響及對最終CPC(頭孢菌素C)合成量的影響還未見報道。本發明人在制備頭孢菌素C的發酵過程中，在發酵培養基中分別按一定比例添加了前體物質之一的L-α-氨基己二酸、D-α-氨基己二酸或者D,L-α-氨基己二酸，發現促進了頭孢菌素C的生物合成能力，并提高了發酵效價。同時，本發明人優化了種子培養基和發酵培養基的營養組成配方以及發酵工藝，使發酵效價最佳化。

發明內容

技術問題

因此，本發明的目的在于提供一種發酵效價、生產效率高的改進的制備頭孢菌素C的發酵方法。

本發明的另一目的在于提供一種在所述制備頭孢菌素C的發酵方法中使用的發酵培養基。

技術方案

根據本發明的一方面，提供一種制備頭孢菌素C的發酵方法，該方法包括如下步驟：

步驟1：取頂頭孢霉，經活化后，接種至種子培養基中，在pH 6.8～7.2、溫度27～30℃下培養60～80小時，制備種子，其中所述種子培養基組成如下：

以去離子水為介質，豆餅粉25～35g/L，玉米漿14～25g/L，蔗糖23～32g/L，葡萄糖8～12g/L，碳酸鈣4～6g/L，以及豆油9～20mL/L；

步驟2：將上述步驟1制得的種子接種至發酵培養基中，在pH 5.2～5.8、溫度24～29℃，發酵110～150小時，其中所述發酵培養基組成如下：

以去離子水為介質，氨基己二酸3～12g/L，花生粉25～45g/L，棉籽蛋白17～30g/L，谷朊粉30～50g/L，豆餅粉20～35g/L，玉米漿40～70mL/L，葡萄糖5～10g/L，蔗糖10～20g/L，蛋氨酸9～15g/L，硫酸銨10～20g/L，硫酸鈣12～18g/L，碳酸鈣5～9g/L，豆油70～120mL/L，以及消泡劑1～2mL/L，

且在發酵過程中，溶解氧濃度在30％以上；根據需要補加硫酸銨、豆油、消泡劑和氨水；

步驟3：將步驟2所得發酵液離心分離，取上層澄清液體，得到頭孢菌素C上清液。