[發(fā)明專利]聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯(lián)物的制備及純化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410517895.6
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104293762A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賀進田;王柱;王改珍
• 申請（專利權(quán)）人: 河北師范大學(xué)
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/48
• 代理公司: 石家莊新世紀專利商標事務(wù)所有限公司 13100
• 代理人: 董金國

技術(shù)領(lǐng)域

?????本發(fā)明涉及一種聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯(lián)物的制備及純化方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

葡激酶（staphylokinase,?Sak）是來源于金黃色葡萄球菌的一種蛋白質(zhì)。Sak不能直接使纖溶酶原?(Plg)?轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin,?Plm)?,?而是先與纖溶酶原結(jié)合形成無活性的?Sak·plg，在少量纖溶酶啟動下，形成活性?Sak·plm，后者進一步激活纖溶酶原分子轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，纖溶酶溶解血栓基質(zhì)纖維蛋白從而溶解血栓。在血漿中，Sak·plm?很快被?α2-抗纖溶酶抑制，不激活纖溶系統(tǒng)；當(dāng)有血栓存在時?Sak·plm?與血栓中的纖維蛋白結(jié)合，α2-抗纖溶酶對?Sak·plm?復(fù)合物的抑制速度會下降100倍。臨床研究結(jié)果表明，葡激酶與美國治療急性心肌梗塞的標準溶栓藥物阿特普酶有等同的溶栓療效，且葡激酶激活纖溶酶原的纖維蛋白特異性更強。然而，葡激酶作為一種外源性的蛋白，有較高的免疫原性，且其半衰期較短，存在易被血液中的蛋白酶降解等缺點，因而，限制了葡激酶的臨床應(yīng)用。聚乙二醇（polyethylene?glycol，PEG）是一種惰性大分子，其水溶性好、不揮發(fā)、無味、不帶電荷,可以獲得多種分子量不同、結(jié)構(gòu)不同的聚合物形式。而且PEG本身免疫原性極弱,通常在PEG修飾物免疫的動物血清中檢測不到特異性的抗PEG抗體。當(dāng)其偶聯(lián)到藥物分子或藥物表面時,可以在其修飾的藥物周圍產(chǎn)生空間屏障,減少藥物的酶解,避免在腎臟中被很快濾過。因而，Sak經(jīng)聚乙二醇修飾后可以克服其免疫原性高、半衰期短、易被腎臟過濾等缺點，使聚乙二醇化葡激酶藥物更適于臨床應(yīng)用。目前，已有許多與葡激酶及聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的制備方法相關(guān)的專利申請，如《一種制備葡激酶的方法》（專利號：ZL200610157156.6），《一種低熱原葡激酶及其制備方法》（專利號：ZL200510022492.5）《一種低免疫原性葡激酶突變體及其制備方法和應(yīng)用》（專利號：ZL200910075186.6）等。上述專利只涉及到重組葡激酶的基因構(gòu)建、誘導(dǎo)表達、分離純化，制得高純度的葡激酶純品，而未涉及后續(xù)的聚乙二醇修飾及修飾產(chǎn)物的分離純化。《聚乙二醇-葡激酶偶物及其制備方法和應(yīng)用》（專利號：ZL99804195.5）提供了以高純度的葡激酶純品為原料制備和純化聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的工藝，該工藝需經(jīng)過兩次冷凍干燥；《一種聚乙二醇化的葡激酶突變體及其制備方法和應(yīng)用》（專利號:ZL201110102611.3）和《免疫原性降低和/或清除率降低的葡激酶衍生物的鑒定、生產(chǎn)和應(yīng)用》（專利號：ZL200910075186.6），雖然全面提供了重組葡激酶突變體基因構(gòu)建、誘導(dǎo)表達、分離純化以及聚乙二醇-葡激酶突變體的制備和純化的工藝過程，但聚乙二醇-葡激酶突變體的整體制備和純化工藝過程繁瑣。以上所有聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物純品制備相關(guān)專利所提供的工藝路線可以分割成了三個階段：一，葡激酶或其突變體經(jīng)過色譜柱層析純化后冷凍干燥，獲得葡激酶或其突變體純品；二，以葡激酶或其突變體純品為原料，與修飾劑反應(yīng)，制備聚乙二醇-葡激酶或其突變體的偶聯(lián)物；三，通過色譜柱層析純化出聚乙二醇-葡激酶或其突變體偶聯(lián)物，冷凍干燥獲得純品。這種工藝路線存在制備工藝繁瑣、周期長、生產(chǎn)成本高、可連續(xù)化生產(chǎn)程度低等不足。并且，制備工藝均需經(jīng)過兩次冷凍干燥，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性聚集和活性降低，而蛋白質(zhì)變性聚集導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)品體內(nèi)免疫原性升高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯(lián)物的制備及純化方法，克服了現(xiàn)有工藝存在的不足。

本發(fā)明是使用聚乙二醇修飾劑共價修飾葡激酶突變體（Sak-E80C；80位的谷氨酸突變成半胱氨酸）特定位點來制備聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯(lián)物的，其中，聚乙二醇修飾劑為羥基-馬來酰亞胺聚乙二醇(MAL-PEG-OH；Maleimide?PEG?Hydroxyl),購自北京鍵凱科技有限公司，其分子量為2000或5000或7500。葡激酶突變體為Sak-E80C，按摩爾比，葡激酶突變體：修飾劑=1:（3-10）。

????具體的，本發(fā)明的聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯(lián)物的制備及純化方法，包括以下步驟：

（1）將表達葡激酶突變體Sak-E80C的工程菌接種于液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6h后，升溫至42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，然后，4℃、5,000?rpm離心10?分鐘收菌，棄上清，用含有0.01M?EDTA（乙二胺四乙酸）和0.01M二硫蘇糖醇的0.02M?NaAC-HAC(醋酸鈉-醋酸)緩沖液，pH=5-6，懸浮菌體進行超聲破碎，破碎后4℃、12,000?rpm高速離心20?min，收集上清液；