[發(fā)明專利]聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯(lián)物的制備及純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410517895.6
• 申請(qǐng)日: 2014-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104293762A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀進(jìn)田;王柱;王改珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/96
• 分類號(hào): C12N9/96;C12N9/48
• 代理公司: 石家莊新世紀(jì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 13100
• 代理人: 董金國(guó)

1.一種聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯(lián)物的制備及純化方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）將表達(dá)葡激酶突變體Sak-E80C的工程菌接種于液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6h后，升溫至42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，然后，4℃、5000?rpm離心10?分鐘收菌，棄上清，用pH=5-6、含有0.01M?EDTA和0.01M二硫蘇糖醇的0.02M?NaAC-HAC緩沖液，懸浮菌體進(jìn)行超聲破碎，破碎后4℃、12000?rpm高速離心20?min，收集上清液；

（2）將上清液pH調(diào)至5.6，加入到SP-Sepharose?FF陽(yáng)離子交換層析柱（2.7×30?cm）中，然后用pH=5-6、含有80-1000mM?NaCl和0.01M二硫蘇糖醇的10-50mM?NaAc-HAc緩沖液進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫組分，用SDS-PAGE電泳分析，以確定突變體葡激酶Sak-E80C所在的洗脫峰，從而確定含Sak-E80C的收集液；

將含Sak-E80C的收集液加入到Sephadex?G-50凝膠過(guò)濾層析柱（3.8×100?cm）中，上樣量為凝膠體積的5%，然后用pH=5-6、含0.01M二硫蘇糖醇的10-50mM?NaAc-HAc緩沖液進(jìn)行沖洗，收集相應(yīng)組分，用SDS-PAGE電泳分析，以確定含Sak-E80C的收集液；

（3）用Bradford?法測(cè)定收集液中Sak-E80C的濃度，然后按照摩爾比，Sak-E80C：羥基-馬來(lái)酰亞胺聚乙二醇?=1:（3-10），在室溫下，反應(yīng)進(jìn)行3-5小時(shí)，修飾完成后，用SDS-PAGE電泳和SEC-HPLC分析聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物(HO-PEG-MAL-Sak-E80C；Sak-E80C-HPG)的產(chǎn)率；

將修飾反應(yīng)液加入SP-Sepharose?FF陽(yáng)離子交換層析柱（2.6×25?cm）中，然后用pH=5-6、含有100-200mM?NaCl?的10-50mM?NaAc-HAc緩沖液進(jìn)行洗脫，收集相應(yīng)組分；

????將SP-Sepharose?FF陽(yáng)離子交換層析獲得的收集液加入到?Toyopearl?HW-50F凝膠過(guò)濾層析柱（2.6×100?cm）中，上樣量為凝膠體積的5%，然后用pH=8-9、10-50mM?Tris-HCl緩沖液進(jìn)行沖洗,?分別收集兩個(gè)主要洗脫峰，用SDS-PAGE電泳顯示，其中一個(gè)洗脫峰主要成分為聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物（HO-PEG-MAL-?Sak-E80C-HPG；Sak-E80C-HPG），另一洗脫峰主要為未被修飾的Sak-E80C；?

將含有Sak-E80C-HPG的收集液加入到?Q-Sepharose?FF陰離子交換層柱（1.5×15?cm）中，然后用pH=8-9、含有100-200mM?NaCl?的10-50?mM?Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，收集相應(yīng)組分，用SDS-PAGE電泳分析，以確定含有Sak-E80C-HPG的收集液，最后將含有Sak-E80C-HPG的收集液分裝，進(jìn)行冷凍干燥得到產(chǎn)品。