[發明專利]重組蛋白HarpinZΔ89-124的應用

有效

• 申請號: 201410516133.4
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN104322530A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 高學文;張陽;李響;伍輝軍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01N47/44
• 分類號: A01N47/44;A01P21/00;A01P1/00;A01P3/00;C07K14/21;C12N15/70
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及重組蛋白HarpinZ_Δ89-124的應用。

背景技術

Harpin蛋白是由植物病原細菌產生的一類蛋白質激發子，可以激發非寄主植物產生過敏性細胞死亡((hypersensitive?cell?death,HCD)，誘導植物產生防衛反應，促進植物生長。Harpin蛋白的這些有益效應，可能是通過蛋白質不同的功能域實現的，因此分離、鑒定Harpin蛋白中與抗病、促生有關的功能區域至關重要。

在丁香假單胞菌屬中，對于菜豆致病變種P.syringae?pv.phaseolicola功能域的研究最透徹，認為C-末端對其功能行使至關重要(M.Haapalainen?et?al,2011)，但其中對功能域的研究僅僅局限于理化性質研究，如多肽結合位點，原生質膜脂類結合部位及孔洞的形成等方面，缺乏對植物促生抗病方面的研究。因此，研究Harpin蛋白中與植物抗病、促生等在植物上的有益效應相關的功能區域具有重要意義，為harpin蛋白在農業生產中的應用提供基礎。本實驗室前期已經從丁香假單胞大豆致病變種(Pseudomonas?syringae?pv.glycinea)S1菌株中克隆到大小為1038?bp的hrpZ基因，并利用大腸桿菌表達。研究表明，HarpinP_sgS1具有誘導煙草抗病和促生的效果。本發明在此基礎上，通過研究HarpinP_sgS1中決定HR反應、抗病、促生等生物學效應的功能域，得到抗病、促生效果更好的短肽片段，更易于體外表達，提高產量和節約成本，利于微生物蛋白農藥的產業化。

發明內容

本發明的目的是提供一種重組蛋白HarpinZ_Δ89-124的應用。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示的重組蛋白HarpinZ_Δ89-124在提高煙草抗煙草花葉病毒病效果、促進水稻生長、提高水稻抗白葉枯病中的應用。

其中，所述的重組蛋白HarpinZ_Δ89-124通過以下步驟制備得到：

(1)以DH5α/pMD18-T-hrpZ_PsgS1菌株提取的質粒DNA為模板，用上游引物hrpZ_Δ89-124-P1、下游引物hrpZ_Δ89-124-P2進行反向PCR擴增，用凝膠回收試劑盒將反向PCR擴增的片段回收純化，利用T4?DNA連接酶將回收后的片段進行DNA分子自行環化后，轉入大腸桿菌DH5α，經酶切及測序驗證得到陽性重組菌株DH5α/pMD18T-hrpZ_Δ89-124，其中上游引物hrpZ_Δ89-124-P1序列如SEQ?ID?NO.3所示，下游引物hrpZ_Δ254-298-P2序列如SEQ?ID?NO.4所示；

(2)陽性重組菌株DH5α/pMD18-T-hrpZ_Δ89-124提質粒DNA，經BamH1和EcoR1雙酶切后連接到表達載體pET30a(+)上，轉入大腸桿菌BL21后經質粒PCR及酶切鑒定出陽性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-₁₂₄；

(3)利用LB培養基培養陽性菌株BL21/pET30a(+)-hrpZ_Δ89-124，并利用IPTG誘導重組蛋白表達，菌體經超聲波破碎獲得粗提蛋白，純化后得純化的重組蛋白HarpinZ_Δ89-124。

有益效果：

1.本發明獲得了一個HarpinZ_PsgS1蛋白的功能片段HarpinZ_Δ89-124，為HarpinZ_PsgS1截去第89-124位氨基酸之后的一個重組蛋白，該蛋白能夠在大腸桿菌體內穩定表達，純化后每升菌液可得到純蛋白約40mg。

2.本發明所獲得的重組蛋白HarpinZ_Δ89-124在植物上具有比全長HarpinZ_PsgS1更好的生物學效應，同濃度的兩個蛋白處理煙草、水稻后，HarpinZ_Δ89-124對煙草抗花葉病毒病效果、對水稻抗白葉枯病效果、水稻促生長效果都顯著優于全長HarpinZ_PsgS1。