[發明專利]一種噬菌體展示表達圓環病毒抗原疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201410515139.X
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN104474540A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 李明義;高江明;劉陽;李曉林;單學強;張倫;馮晶晶;李佳棋;孫化露;葛棟;郭春麗
• 申請（專利權）人: 山東信得科技股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;C12N15/70;C07K14/01;C07K16/08;C07K16/06
• 代理公司: 北京康盛知識產權代理有限公司 11331
• 代理人: 張良

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種噬菌體展示表達圓環病毒抗原疫苗的制備方法。

背景技術

豬圓環病毒感染是由圓環病毒引起的豬的一種急性傳染病。主要特征為消瘦、體質下降、貧血、黃疸、腹瀉、發育不良、呼吸困難、母豬繁殖障礙的。伴有廣泛的病理化。根據其血清型的不同可分為PCV1及PCV2。其中我國報道較多感染比較嚴重的為PCV2。目前治療PCV2的方法多方法復雜，成本較高，從技術上取得的效果收益甚微。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種噬菌體展示表達圓環病毒抗原疫苗的制備方法，用以控制豬圓環病毒Ⅱ型病的感染，減少危害。

本發明提供了一種噬菌體展示表達圓環病毒抗原疫苗的制備方法，為了對披露的實施例的一些方面有一個基本的理解，下面給出了簡單的概括。

本發明的一種噬菌體展示表達圓環病毒抗原疫苗的制備方法包括以下步驟：

提取豬圓環病毒Ⅱ型(PCV2)病毒培養液RNA，反轉錄，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增獲取豬Ⅱ型圓環病毒ORF2開放閱讀框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后將所述豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因片段鉚定定向插入T4噬菌體；利用所述T4噬菌體侵染X-Blue?ST1?CCTCC?M?2014397宿主細胞，原核表達OFR2基因重組蛋白，并免疫動物制備多抗，?利用制備的豬圓環病毒Ⅱ型多抗對插入ORF2基因片段的所述噬菌體進行免疫篩選，獲取陽性克隆斑，擴增并測序鑒定插入序列的正確性；獲取具有正確插入ORF2基因的T4噬菌體；經純化后重新侵染X-Blue?ST1?CCTCC?M?2014397宿主細胞；

噬菌體再次侵染X-Blue?ST1?CCTCC?M?2014397宿主細胞，發酵培養，OD值為0.6時，加入終濃度為100μg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達2h，誘導表達后培養物加入終濃度為1％的甲醛并在4℃，轉速為120r/min下震蕩滅活24小時；處理后的培養物作為免疫抗原。利用PCV2弱毒疫苗免疫豬，制備豬的抗PCV2病毒的陽性血清；利用間接酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)方法檢測制備的抗PCV2血清的效價，再根據所測得的效價，把抗體效價稀釋成為1:300；用標定好的抗血清檢測培養物抗原效價，并用生理鹽水倍比稀釋，稀釋抗原終濃度為107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐劑，即得到最終所獲得疫苗。

其中，以下菌株保藏于中國典型培養物保藏中心：

大腸桿菌Escherichia?coli?X-Blue?ST1；

保藏編號：CCTCC?M?2014397；

保藏日期：2014年9月1日；

簡稱為X-Blue?ST1；

保藏于中國，武漢，武漢大學。

本發明的有益效果如下：

通過制備帶有PCV2病毒的噬菌體展示表達抗原，并把其制備成疫苗，取得較好的保護效果。且可以大量生產只需細菌發酵培養，生產成本低于現行的細胞培養。由于噬菌體展示表達圓環病毒抗原疫苗是重組單蛋白抗原，并且T4噬菌體感染具有細胞嗜性，避免了現行活疫苗返毒及引入外援病原體感染的風險。該疫苗易于制備且利于大規模生產及使用。

為了上述以及相關的目的，一個或多個實施例包括后面將詳細說明并在權利要求中特別指出的特征。

附圖說明

圖1ORF2基因PCR擴增產物電泳圖；

圖2ORF2抗原蛋白的抗原表位分析。

具體實施方式

以下優選實施例，對本發明作詳細描述，以使本領域的技術人員能夠實踐它們。

下面對本發明做詳細描述。

實施例1豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的獲取及免疫篩選多抗的制備

1豬圓環病毒Ⅱ型ORF2基因的獲取。?

GENBANK上查找PCV2的ORF2序列，根據所獲得的序列查找開放閱讀框，并根據開放閱讀框的序列設計以下引物：

上游引物5’-CGGGTACCGCCACCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’

下游引物5’-GCGGATCCTCACTTAGGGTTAAGTGGGGGG-3’

提取豬圓環病毒Ⅱ型病毒培養液的mRNA，反轉錄為cDNA,并以此為模板PCR擴增ORF2片段，目的基因擴增結果如圖1所示，704bp中為目的條帶，連接PMD-18T載體，測序獲得的基因片段的特征如下：