[發(fā)明專利]一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410515139.X
• 申請(qǐng)日: 2014-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104474540A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明義;高江明;劉陽(yáng);李曉林;單學(xué)強(qiáng);張倫;馮晶晶;李佳棋;孫化露;葛棟;郭春麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東信得科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;A61P31/20;C12N15/70;C07K14/01;C07K16/08;C07K16/06
• 代理公司: 北京康盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11331
• 代理人: 張良

1.一種噬菌體展示表達(dá)圓環(huán)病毒抗原疫苗的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

提取豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)病毒培養(yǎng)液RNA，反轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲取豬Ⅱ型圓環(huán)病毒ORF2開(kāi)放閱讀框基因片段，制成改造后的ORF2基因片段，然后將所述豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2基因片段鉚定定向插入T4噬菌體；利用所述T4噬菌體侵染X-Blue?ST1CCTCC?M2014397宿主細(xì)胞，原核表達(dá)OFR2基因重組蛋白，并免疫動(dòng)物制備多抗，利用制備的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型多抗對(duì)插入ORF2基因片段的所述噬菌體進(jìn)行免疫篩選，獲取陽(yáng)性克隆斑，擴(kuò)增并測(cè)序鑒定插入序列的正確性；獲取具有正確插入ORF2基因的T4噬菌體；經(jīng)純化后重新侵染X-Blue?ST1CCTCC?M?2014397宿主細(xì)胞；

噬菌體再次侵染X-Blue?ST1CCTCC?M?2014397宿主細(xì)胞，發(fā)酵培養(yǎng)，OD值為0.6時(shí)，加入終濃度為100μg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)2h，誘導(dǎo)表達(dá)后培養(yǎng)物加入終濃度為1％的甲醛并在4℃，轉(zhuǎn)速為120r/min下震蕩滅活24小時(shí)；處理后的培養(yǎng)物作為免疫抗原；利用PCV2弱毒疫苗免疫豬，制備豬的抗PCV2病毒的陽(yáng)性血清；利用間接酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)方法檢測(cè)制備的抗PCV2血清的效價(jià)，再根據(jù)所測(cè)得的效價(jià)，把抗體效價(jià)稀釋成為1:300；用標(biāo)定好的抗血清檢測(cè)培養(yǎng)物抗原效價(jià)，并用生理鹽水倍比稀釋，稀釋抗原終濃度為107U/ml；以1:2.5的比例加入疫苗佐劑，即得到最終所獲得疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2基因片段鉚定定向插入T4噬菌體方法為：將所述改造后的ORF2基因片段連接插入pMD-18T載體，制成pMD-18T-ORF2；利用EcoR?Ⅰ和hindIII雙酶切，回收酶切片段，并用EcoR?Ⅰ和hindIII酶切T4噬菌體表達(dá)質(zhì)粒；回收酶切片段，T4連接酶連接基因片段到T4噬菌體的SOC位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒Ⅱ型多抗的制備方法為：

用EcoRⅠ和hindIII分別雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-ORF2和表達(dá)載體pET-28a(+)；以4μl?ORF2基因片段、1μl?pET-28a(+)載體片段、1μl?T4DNA酶、1μl連接酶緩沖液、3.5μl?ddH2O的體系，4℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃熱應(yīng)激90s，冰浴2-3min，加1ml?LB液體培養(yǎng)基37℃搖40min，均勻涂在含氨芐西林(100μg/ml)的LB平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取陽(yáng)性菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雙酶切鑒定，得到pET-28a-ORF2；

將所述pET-28a-ORF2轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli?BL21(DE3)中，在含50μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單菌落，加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液A600達(dá)0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，37℃振蕩誘導(dǎo)4h，離心，收集菌體；取1ml菌液，4℃，8000g/min離心5min，保留沉淀物，菌體用PBS反復(fù)沖洗兩次，再進(jìn)行超聲，超聲儀設(shè)置為130W、開(kāi)5s、停5s，超聲30min，12000r/min離心15min，收集沉淀；向沉淀物中加入70μl?1×TE緩沖液，重懸沉淀，加入4.5μl二硫蘇糖醇(DTT)，2μl?5×上樣緩沖液，煮沸10min，4℃，10000g離心10min，取15μl上清進(jìn)行SDS-PAGE分析；條帶正確后，用含有8M尿素的緩沖液重懸沉淀；4℃條件下溶解1h；過(guò)鎳柱，分離純化表達(dá)的重組蛋白，對(duì)純化復(fù)性的原核表達(dá)蛋白進(jìn)行梯度復(fù)性，并透析濃縮；用純化復(fù)性的原核表達(dá)蛋白免疫豬(每頭20mg),三免后采血，重組蛋白抗原包被ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，抗體效價(jià)大于1:16時(shí)，采血，靜置析出，離心后獲得血清作為多抗。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述原核表達(dá)，表達(dá)并純化所述豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2重組蛋白，用重組蛋白制備多克隆血清，并利用獲取的陽(yáng)性多克隆血清，把插入ORF-2基因的T4噬菌體從T4噬菌體文庫(kù)中篩選出來(lái)，免疫篩選獲取陽(yáng)性克隆斑，純化測(cè)序鑒定，并把其作為侵染新的X-Blue?ST1CCTCC?M?2014397宿主細(xì)胞的種毒。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗佐劑為化妝品級(jí)白油。